Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.
The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation.
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiæ, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.
Большинство исследований флуоресценции внутри живых клеток зависит от слитых белков с флуоресцентными белками (FPS), таких как GFP 1. Эти флуоресцентные метки позволяют исследования числа копий, диффузии рисунком или локализации белков, участвующих в процессах, таких как генной экспрессии или мембранного транспорта 2-7. Рамочные обеспечивают высокую маркировки специфику, простоту реализации, и доступны в большом инвентаризации вариантах с различной фотофизических и химических свойств 1. Тем не менее, органические флуорофоры остаются основным выбором для экспериментов в пробирке из-за их большей фотостабильностью (до 100 раз более устойчивы, чем FPS) 8,9, малый размер (до 100 раз меньший объем, чем FPS) и легкость внутримолекулярной маркировки (главным образом, за счет использования остатков цистеина). Все эти факторы особенно важны для флуоресценции одиночных молекул и FRET исследования 10.
Несколько методов интернализации Combinчисле преимущества органического маркировки и при обнаружении естественных были введены в последнее десятилетие; Однако, такие методы либо используют относительно большие полипептиды меток (например, TMP, галоген или 20 кДа SNAP метки) 11-14, требуют использования неприродных аминокислот 15, или ограничиваются большими, одной мембраны эукариотических клетках (например. загрузка путем соскоба, шприц нагрузку, микроинъекции) 16-19.
Этот протокол описывает новый, простой и высокой пропускной метод интернализации, которая соединяет преимущества органических флуорофоров с наблюдением в естественных условиях. Для разработки этого метода, мы адаптировали процедуры электропорации, который обычно используется для трансформации клеток плазмидой ДНК 20,21, чтобы загрузить микроорганизмов, таких как E. палочки или S. Cerevisiae с органически маркированных биомолекул. Протокол состоит из 4 простых шага: инкубация клеток с мечеными биомолекул,электропорации, восстановление клеток и стиральная клеток для удаления не усвоены биомолекул. Здесь мы представляем этот электропорации протокол, а также ячейки изображения и анализа данных процессов для исследования флуоресценции клеток на основе и одиночных молекул и ладу сигналы.
Электропорации зависит от выгрузки электрическое поле высокого напряжения на низкой ионной силы суспензии клеток с образованием переходные поры мембраны, через которые биомолекулы могут проникать в клетки (фигура 1) 20,21. Так же, как трансформации бактерий или дрожжей с плазмидной ДНК, клетки должны быть подготовлены до электропорации, чтобы обеспечить их electrocompetency. Эта процедура, состоящая из нескольких стадий промывки водой, увеличивает проницаемость мембран и снижает ионной силы раствора клеток, чтобы избежать искрения в кювету для электропорации. В этом протоколе, клетки могут быть получены, как описано ниже (см протокол: 1,1) или покупали у коммерческого поставщикас.
Рисунок 1: Схематическое представление протокола интернализации Слева направо:. Добавить несколько микролитров меченых биомолекул на аликвоты электрокомпетентных клеток (фрагментов дважды меченных ДНК и бактерии в этом примере); инкубировать от 1 до 10 мин на льду и переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации; электропорации, а затем добавить 0,5-1 мл обогащенной среды к клеткам непосредственно после; инкубировать при 37 ° С (или требуемой температуры в организме, например, 29 ° C для дрожжей), чтобы восстановить клетки; Выполните 5 стиральные шаги, чтобы удалить лишнюю, не являющихся усвоенные меченые молекулы; ресуспендируйте конечный осадок в 100-200 мкл буфера PBS и пипеткой 10 мкл на агарозном площадку; покрыть панель с очищенной покровного и изображения на флуоресцентного микроскопа (в режиме широкого поля или в режиме Хило).
В то время как интернализация ДНК является прямым (рис 2), меры предосторожности должны быть приняты при интернализации меченых белков с помощью электропорации, Во-первых, акции образец органично меченого белка может по-прежнему содержат небольшой процент свободного красителя. Молекулы свободного красителя значительно меньше, чем белков и, следовательно, может быть усвоены преимущественно. Для того, чтобы подавляющее большинство наблюдаемых интернализованных флуоресцентных молекул соответствует белку интереса, исходный образец белка должны содержать не более ~ 2% свободного красителя (рисунок 5) 22. Избыток без интернализированных меченых белков также может прилипнуть к наружной клеточной мембране после электропорации; Это явление является белок-специфических и должна быть проверена для каждого нового белка. Мы предлагаем несколько вариантов, которые позволяют удаление не-усвоены белков из загруженного образца клеток (см протокола: 3.3.3).
Наконец, клетки ресуспендировали в небольшом объеме фосфатного буфера и пипеткой на агарозном площадку, что позволяет их изображений на флуоресцентном микроскопе. Иммобилизация на агарозном колодок Симпле и эффективный способ визуализации клеток на покровное без ущерба для их целостности. Прокладка должна содержать питательную среду с низким уровнем флуоресценции.
Изображений клеток может быть выполнено либо в широкопольных, общая флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) или с помощью Хило (с большим углом наклонения и ламинированные Оптический лист) микроскопии. В конфигурации Хило, лазерный луч проникает глубже в образец, чем в TIRF, пока не осветить весь образец, как и для широкопольных, что позволяет большее отношение 23 сигнал-шум. В зависимости от разрешения мощности лазера и используемого времени усвоенные биомолекулы, можно пересчитать (с использованием ступенчатого фотообесцвечиванию анализ, рис 3), локализованы, или гусеничный 24-28. Интернализации дважды меченных конструкций с лобзиком пары флуорофоров позволяет оценить количественно FRET как на одноклеточных или уровни одной молекулы (рисунок 6).
Различные параметры могут быть измененыВ зависимости от желаемой производительности и биологической системы исследуемого. Во-первых, количество интернализованной материала на клетку может быть настроена путем изменения концентрации меченых биомолекул к клеткам добавляли предварительного электропорации (рисунок 2). Сила Электропорация поле также будет влиять как эффективность загрузки и жизнеспособность клеток; как и следовало ожидать, в то время как при увеличении эффективности загрузки с увеличением напряженности поля, жизнеспособность электропорации клеток уменьшается (фиг.4А). Оба параметра могут быть определены количественно путем записи процент загружен и делящиеся клетки после электропорации. Это жизнеспособность анализ в сочетании с флуоресцентной томографии также проверяет соблюдение интернализованных биомолекул в живых клетках и позволяют непрерывное наблюдение в течение нескольких поколений (рис 4б).
В целом, этот протокол позволяет интернализации флуоресцентно меченых ДНК и белка молекул вE.coli или S. Cerevisiae 26. Отдельные молекулы, меченные органических флуорофоров могут быть отслежены с высокой пространственно-временной разрешающей способности для временных масштабах порядок больше, чем FPS. И, наконец, этот способ является совместимым с широким полем зрения, TIRF и конфокальной обнаружения, а также импульсных схем возбуждения, такие как Алекс (переменный лазерное возбуждение 28,29).
Многие параметры могут быть изменены во время клеточного электропорации и сбора данных в зависимости от биологической системы интересов и точный характер эксперимента (сотовый уровня или анализа одиночных молекул). Например, при электропорации ДНК в бактерии, от 0,25 до 5 пмоль дцДНК меченых фрагментов приводит к низкой эффективности интернализации, что позволяет обнаруживать прямую одной молекулы (т.е.., Без необходимости предварительно фотообесцвечивание). Над 5 пмоль дцДНК клетки, как правило, сильно загружен, режим лучше всего подходит для анализа одного элемента. Все меченые ДНК должна быть выше очищали на геле, чтобы удалить все следы свободного красителя (непрореагировавший флуорофор) из маточного раствора ДНК. Кроме того, потенциальные проблемы, связанные с деградацией ДНК, в частности, для smFRET экспериментов, могут быть решены с помощью ДНК с неестественной нуклеиновых кислот, или мотивами, которые защищают экзонуклеазную доступной концы, такие как шпильки петель.
Еще adjustablе параметр электропорации является напряженность поля применяется во электропорации. Низкий напряженность поля (~ 1 кВ / см) будет приводить к низкой эффективности загрузки, соответствующим одной молекулы исследований. Более высокие значения напряженности поля (до 1,8 кВ / см) позволит повысить эффективность погрузки; Однако, есть обратная корреляция между напряженности поля и жизнеспособности клеток после электропорации (см рисунок 4). Для справки, нормальный напряженность поля для бактерий и дрожжей электропорации составляет ~ 1,5 кВ / см. Постоянная времени, представляющий длину этого распада, является удобным параметром, чтобы следовать, так как постоянная времени падает, как только любой дуги явление происходит в кювете. В нормальных условиях, постоянная времени должна быть больше, чем 4 мс; Более низкие значения приведет к низкой эффективности загрузки или даже без загруженных поврежденных клеток. Большинство electroporators предложить другие степени свободы (например, «Пульс усечения" или "форму импульса»), который может быть изменен, чтобы настроиться иЗагрузка клеток и жизнеспособность. Мы применили этот метод для обеих бактерий и дрожжей, однако подобные процедуры должны также позволить интернализации меченых биомолекул в клетки млекопитающих с использованием соответствующих параметров Электропоратор поскольку их мембраны на самом деле меньше комплекс (один липидный бислой), а с электропорации уже был использован с такими клетками 21.
При интернализации меченых белков, все свободное краситель должен быть удален из меченого белка основного раствора предварительного электропорации. Молекулы свободного красителя, из-за их меньшего размера, может быть усвоены преимущественно за интерес белков, и их трудно различить в процессе анализа данных (несмотря на их ожидаемой более быстрой диффузии). Как руководство, для образца органично меченого белка, чтобы служить для электропорации, количество оставшихся бесплатных краситель должен быть ниже 2% (обнаруженных с помощью флуоресцентного сканирования в SDS-PAGE) 22. Этот процесс особенно важно,а некоторые молекулы могут прилипать к наружной мембраны электропорации бактерии или дрожжи. В этом отношении, отрицательный контрольный образец должен отображать интенсивность флуоресценции на клетку значительно ниже, чем электропорации клеток, в идеале, как низкий, как уровень автофлуоресцентной пустых ячеек (клеток, которые не были инкубировали с любыми флуоресцентно меченных биомолекул, ни электропорации, рисунок 2).
Как и в двухцепочечной ДНК, эффективность интернализации меченых белков связана с количеством биомолекул к клеткам добавляли предшествующих электропорации. Тем не менее, другие параметры, такие как размер и заряд, играют важную роль в интернализации. Маленькие белки обладают высокой эффективностью интернализации, в то время как более крупные белки (до 98 кДа) может быть успешно усвоены, но с меньшей эффективностью (рис 5) 26. Isolelectric точки белка, потенциальные взаимодействия с клеточной мембраной и другие физико-химические параметры такженагрузочной ячейкой влияние во время электропорации. В результате, пользователи должны оптимизировать эксперименты по своей собственной системе, зная, что высокая начальная концентрация меченого белка (> 50 мкм) даст наилучший шанс для успешной загрузки. Электропорация также предлагает новый инструмент для возмущения и анализировать клеточную функцию путем введения белков и других биомолекул в клетки (либо помеченных или немаркированные). Т7 РНК-полимеразы эксперименты (фиг 5с), присутствующие такой пример эксперимента, где можно ввести биомолекулы, которые могут изменить экспрессию гена в естественных условиях с использованием электропорации.
При выполнении одиночных молекул эксперименты флуоресценции, освещение МДП, как правило, отдается предпочтение по сравнению другими видами освещения, как это предлагает лучшее соотношение сигнал-шум, возбуждая только флуорофорами в тонкой части над поверхностью покровного (~ 100 нм). Однако изображений помечены биомолекулы рассеивающие внутри живых микроорганизмов может повторнодесть глубже освещение (до 0,8 мкм для кишечной палочки). Глубже освещение достигается в режиме Хило, сохраняя при этом высокое соотношение сигнал-шум. С другой стороны, широкое поле изображения является особенно важным для ступенчатого анализа фотообесцвечивания, когда пользователь оценки количества интернализированных молекул фотообесцвечивание весь загруженный клетки с высокой мощности лазера и деления начальной интенсивности флуоресценции клеток унитарным света, излучаемого одной молекулы (одного шага фотообесцвечивания, рис 3). Изображения Widefield также необходим для отслеживания долгосрочных молекулы для того, чтобы локализовать рассеивающие молекулы, представляющие интерес, даже если их траектории охватывают весь объем клеток.
В этом протоколе, мы представляем, как электропорация, стандартная техника для биологов и биохимиков для доставки нуклеиновых кислот в клетках, представляет собой простой способ для доставки флуоресцентных биомолекулы в различных типах клеток. Thявляется новым, техника высокой пропускной предлагает уникальный инструмент для наблюдения меченые молекулы в их родной среде. Кроме того биомолекул, меченных флуорофоры, охватывающих широкий диапазон длин волн, электропорации может доставить молекулы, модифицированные многих химических групп, таких как неестественных нуклеотидов и аминокислот, металлических энтеросорбенты, сшивающих агентов, и доступа к файлам групп. Если биологическая система представляет интерес не является необходимым для развития клеток, ген, кодирующий целевой белок, также могут быть удалены (или разобранном), гарантируя, что белки, наблюдаемые после интернализации представляют все (или большинство) из внутриклеточного пула белка , В сущности, электропорации может "пересадка" гибкость биоконъюгатов в пробирке в живых клетках и, следовательно, на пользу усилия в области синтетической биологии, системной биологии и обнаружения одиночных молекул VIVO.
The authors have nothing to disclose.
We thank Stephan Uphoff for discussions.
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ElectroMax DH5-alpha Comptent cells | Invitrogen | 11319-019 | or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast. |
EZ Rich Defined Madia | Teknova | M2105 | low fluorescence rich media |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | or any classical electroporator for microorganism transformation |
Certified Molecular Biology agarose | Biorad | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
Microscope coverslips No 1.5 thickness | Menzel | BB024060SC | remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1h |
Single-molecule fluorescence microscope | Home-built | described in REFs | |
Localization software | Custom-written, available online | MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. | |
Tracking software | Available online | MATLAB implementation by Blair and Dufresne. |