Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.
يسين مثيلة هو التعديل بعد الترجمة الناشئة وتم التعرف على العديد من هيستون وغير هيستون-البروتينات، حيث أنه يلعب دورا حاسما في تطوير خلية والعديد من الأمراض. وقد تم تحديد مواقع 5،000 مثيلة ليسين تقريبا على البروتينات المختلفة، وهي تحدد من قبل عدد قليل العشرات من ميثيل البروتين ليسين. وهذا يشير إلى أن كل PKMT methylates بروتينات متعددة، ولكن حتى الآن تم التعرف على واحد أو اثنين فقط ركائز للعديد من هذه الإنزيمات. تحليلات لنهج هذه المشكلة، أدخلنا مجموعة الببتيد تستند الركيزة خصوصية PKMTs. صفائف الببتيد هي أدوات قوية لتوصيف خصوصية PKMTs بسبب مثيلة من عدة ركائز مع سلاسل مختلفة يمكن اختبارها على مجموعة واحدة. نحن توليفها صفائف الببتيد على غشاء السليلوز باستخدام المزج Intavis SPOT وتحليلها خصوصية مختلف PKMTs. وبناء على هذه النتائج، بالنسبة للعديد من هذه الإنزيمات، رواية الصورةيمكن تحديد ubstrates. على سبيل المثال، لNSD1 من خلال توظيف صفائف الببتيد، أظهرنا أنه methylates K44 من H4 بدلا من H4K20 ذكرت وبالإضافة H1.5K168 هو الركيزة يفضل بدرجة كبيرة خلال H3K36 المعروفة سابقا. وبالتالي، صفائف الببتيد هي أدوات قوية لتوصيف كيميائيا وPKMTs.
في العقدين الأخيرين، أظهرت عدة تقارير على أهمية التعديلات بعد متعدية (PTM) في التنمية الخلوية والعديد من الأمراض مثل السرطان، ولكن في الآونة الأخيرة البروتين يسين مثيلة قد ظهرت كعامل حيوي PTM آخر. في حين تم العثور على هيستون في البداية مثيلة ليسين ليكون علامة لونين الأساسية، وأظهر العمل في وقت لاحق أيضا يسين مثيلة من عدة بروتينات غير بسيطة 1-4. يتم تحفيز نقل متتابعة من مجموعات الميثيل من S-adenosyl-L-ميثيونين إلى مجموعة-ε الأمينية من بقايا يسين من قبل عائلة من الإنزيمات يسمى البروتين ليسين ميثيل (PKMTs) الذي يحتوي على أكثر من 60 البروتينات في الجينوم البشري. وقد اكتشفت في البداية PKMTs كما هيستون تعديل الانزيمات التي ميثيل بقايا يسين محددة ولكن أظهرت تقارير لاحقة أنها يمكن أيضا ميثيل البروتينات غير بسيطة 5. حتى الآن، تم تحديد ما يقرب من 5،000 مواقع مثيلة ليسين على البروتينات المختلفة 6 </sتصل>، ولكن غالبا ما لا يتم التعرف على الانزيمات المسؤولة عن هذه التعديلات. وأحد أسباب ذلك هو أن خصوصية أكثر PKMTs لم يدرس على نطاق واسع. ولذلك، فإنه يحدث متكرر أن ركائز جديدة للPKMTs يتم اكتشافها. عدم وجود معرفة مفصلة من خصوصية الركيزة من PKMTs يعيق فهم وظيفتها البيولوجية ودورها. لدراسة خصوصية من PKMT بالتفصيل، يجب أن تقاس معدلات مثيلة من العديد من ركائز الببتيد التي تختلف في واحد أو عدد قليل من الأحماض الأمينية ومقارنة، والتي تتم بشكل مثالي باستخدام صفائف الببتيد. استنادا إلى ملامح خصوصية الناتجة عن ذلك، يمكن تحديد ركائز المحتملة للPKMTs التي يمكن مزيد من الدراسة.
وتستخدم على نطاق واسع صفائف الببتيد أدوات لتحليل الكيمياء الحيوية من الأجسام المضادة، الببتيد الانزيمات تعديل ورسم خرائط لمواقع التفاعل البروتين البروتين (الضد مستضد، مستقبلات يجند) 7-9. وهناك حاجة إلى عدة مئات من الببتيدات لSUCح التطبيقات. وطرق المختلفة المتاحة لتخليق الببتيد، الببتيد التوليف بينها على الراتنج يستخدم عادة للغاية، ولكن له حدود في الإنتاجية وأنها مكلفة نسبيا. تم حل هذه القضايا مع إدخال طريقة تركيب SPOT فرانك وزملاؤه 10. يسمح للطريقة التوليف SPOT تجميع لعدة مئات من الببتيدات بالتوازي وفي المتوسط أنها غير مكلفة مقارنة توليف الراتنج. الببتيدات توليفها على غشاء السليولوز يمكن استخدام إما مباشرة لمختلف التطبيقات أو الببتيدات يمكن المشقوق من الغشاء واستخدامها كأداة الببتيدات المجانية للفي المقايسات حل أو لإعداد ميكروأرس الببتيد 10-13.
SPOT التوليف هو البديل من الببتيد مرحلة التوليف الصلبة، والذي يستخدم غشاء السليلوز كدعم قوي وتوظف القياسية Fmoc الكيمياء 10-13. وبالتالي، فإن تركيب سلاسل الببتيد يبدأ في نهاية-C محطة ويمضي نحونهاية-N محطة على النقيض من التوليف البيولوجي في ريبوسوم. وبين functionalized أغشية السليلوز لإلحاق أول الأحماض الأمينية تنشيط (الشكل 1). وتستند هذه الطريقة SPOT على تسليم متتابعة من الأحماض الأمينية تفعيلها في بقطرة من المذيب إلى مناطق محددة على الغشاء باستخدام نظام pipetting لالآلي. والاستغناء عن قطرة من السائل على غشاء مسامي حيث أنها تشكل بقعة دائرية الرطب، الذي يعمل في وقت لاحق كما مفاعل مفتوحا لتفاعلات كيميائية في التوليف الببتيد. يتم تحديد حجم بقعة على حجم الاستغناء والقدرة الاستيعابية للغشاء، يتم ترتيب مضاعفات مثل هذه البقع كما المصفوفات. حجم التوليف يرتبط حجم البقعة وقدرة التحميل من الغشاء. المسافة بين البقع وكثافة صفائف تدار من قبل متفاوتة الأحجام الفور. غشاء السليلوز لديها العديد من المزايا على النحو المرحلة الصلبة في التوليف الببتيد، أنها غير مكلفة، متسامح إلى كيميائياعتلال الأعصاب الحركية المستخدمة في تركيب الببتيد، مستقرة في المحاليل المائية وسهلة في التعامل معها. وبالإضافة إلى ذلك، طبيعته المحبة للماء يجعلها مناسبة لعدة أنظمة الفحص البيولوجية. يمكن أن يتم تركيب SPOT يدويا أو آليا (ل1000s من الببتيدات) اعتمادا على العدد المطلوب من الببتيدات. ويستخدم مركب SPOT مؤتمتة بالكامل من Intavis (كولن، ألمانيا) لطلباتنا. ويسمح تركيب الببتيدات في كميات مختلفة وطول مختلف. وقد تم تجميع الببتيدات الخطية بانتظام مع 15 إلى 20 الأمينية طول حامض، في الببتيدات إضافة ما يصل إلى 42 من الأحماض الأمينية يمكن أيضا أن تكون خطوة حكيمة التوليف 14،15 إعدادها. ومع ذلك، زيادة عدد الأحماض الأمينية يؤدي إلى تخفيضات في العوائد اقتران الشاملة، مما يؤثر على نوعية من الببتيدات. ونظرا لكمية قليلة من الببتيدات في بقعة، والمنتجات وغالبا ما تكون صعبة لتنقية ونوعية الببتيدات الفردية لا يمكن تقييمها بسهولة. ولذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها من SPOT peptلا بد من تأكيد صفائف بيئة تطوير متكاملة سواء مع الببتيدات توليفها من قبل الأساليب القياسية في نطاق أوسع، والتي يمكن تنقيتها وتحليلها وفقا للمعايير في التوليف الببتيد أو عن طريق تجميع البروتينات التي تحتوي على سلاسل الببتيد المطلوب. ومع ذلك، وجدنا التوليف SPOT أن تكون موثوق بها للغاية ويؤدي عموما أن يكون استنساخه. لا يقتصر التوليف SPOT لproteinogenic الأحماض الأمينية، والعديد من الأحماض الأمينية تعديل المتاحة تجاريا كما يمكن استخدامها لتخليق، مما يسمح الببتيدات إلى أن يتم تعديل قبل وبعد الانقسام النهائي للمجموعة حماية الجانب السلسلة، وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح أيضا إدماج فسفرته، مميثل أو الأسيتيل الأحماض الأمينية 11.
مكتبات الببتيد ثبتوا توليفها من خلال طريقة SPOT يمكن استخدامها مباشرة للعديد من المقايسات البيولوجية والبيوكيميائية. نحن العاملين صفائف الببتيد تضم 300-400 الببتيدات للتحقيق في خصوصية ركيزة من PKMTs. لmodifi الأنزيميالموجبة، يتم تحضين صفائف الببتيد مع PKMT منها وصفت [ميثيل 3 H] -AdoMet في العازلة المناسبة. ويتم تحليل الحامض الركيزة منها باتباع نقل الأنزيمية للمجموعات الميثيل المسمى بالإشعاع من AdoMet إلى الركيزة الببتيد عبر تصوير الإشعاع الذاتي (الشكل 3). بواسطة هذا الإجراء، صفائف الببتيد تسمح دراسة مثيلة من ركائز الببتيد مختلفة في نفس الوقت. أحد المزايا المهمة لهذا الأسلوب هو أن جميع الببتيدات وميثليته في المنافسة، هذا إلى أنه خلال المرحلة خطية من حركية مثيلة، ومثيلة النسبي لكل الببتيد يتناسب مع معدل ثابت الحفاز مقسوما على ثابت التفكك (ك القط / K D) من انزيم لالببتيد الركيزة منها. ولذلك، يرتبط مقدار النشاط الإشعاعي إدراجها في كل بقعة مباشرة مع النشاط الأنزيمي نحو الببتيد معين. باستخدامنتائج تجربة مثيلة مجموعة الببتيد، والوضع خصوصية PKMT يمكن تعريف وبناء على هذه الرواية ركائز يمكن أن يستند. صفائف الببتيد تسمح التحقق من صحة كفاءة السريع وتكلفة مثيلة من ركائز جديدة على مستوى الببتيد. لهذا، يتم إعداد المصفوفات التي تحتوي على ركائز جديدة توقع مع الببتيدات المعدلة تحتوي على علاء بدلا من ليز في المواقع المستهدفة وكذلك الببتيدات الإيجابية والسلبية السيطرة. وأخيرا، فإن ركائز الرواية يمكن أن تكون على استعداد كما البروتينات مع المسوخ، والتي يتم تبديل اليس هدف لعلاء ويمكن التأكد من مثيلة في مستوى البروتين. اعتمادا على نتائج، وهذا هو ثم تليها الدراسات البيولوجية معالجة الأدوار المحتملة للمثيلة من ركائز البروتين وصفها حديثا.
التوليف SPOT كما هو موضح هنا هو وسيلة قوية لرسم خريطة مواقع التفاعل البروتين البروتين والتحقيق في التعرف على الركيزة من الببتيد تعديل الانزيمات. ومع ذلك، SPOT التوليف لا يزال لديه بعض العيوب، لأنه على الرغم يتم الإبلاغ عن الببتيدات توليفها من خلال طريقة SPOT أن يكون أكثر م…
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
Piperidine ≥ 99 % for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
Triisopropylsilane 99%, | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
Dichlormethane ≥99,9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
Phoretix software | TotalLab | n.a. |