웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
마우스에서 야생형보다 높게 WNV 타고난 사이토킨 및 T 세포 반응을 유도 감쇠 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 비 구조적 (NS) 4B-P38G 변이체. 최근 골수 분화 인자 88 (에서 MyD88) 시그널링 WNV NS4B-P38G 돌연변이 감염시 초기 T 세포 프라이밍 및 메모리 T 세포의 발달에 중요한 것으로 나타났다. 본 연구에서 두 계측법 기반의 방법을 흐름 – 시험 관내 T 세포 프라이밍 분석 및 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)는 – 수지상 세포 및 T 세포의 기능을 평가하기 위해 사용 하였다. OTII 트랜스 제닉 마우스의 CD4 + T 세포를 표지 – 분석 프라이밍 T 세포에서 세포 증식은 카르복시 플루오 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)으로 두 군의 쥐들로부터 수지상 세포의 공동 배양에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 보다 크게 전통 전체적인 감도를 개선하여 이러한 접근법은 CD4 + T 세포 증식의 비율의 정확한 결정을 제공알 방사성 시약 분석. microcentrifuge 관 시스템은 ICS 프로토콜 모두 세포 배양 및 사이토킨 염색 절차에서 사용 하였다. 기존의 조직 배양 플레이트 기반 시스템에 비해,이 수정 절차는 바이오 안전성 레벨 (BL) 3 시설에서 수행 쉬웠다. 또한, WNV- 감염된 세포는 BL3 시설 외부의 추가 분석을 가능 모두 분석에 파라 포름 알데히드로 처리 하였다. 전반적으로, 이러한 시험 관내 면역 분석법 효율적 WNV 감염시 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다.
Introduction
웨스트 나일 바이러스 (WNV), 신경성, 플러스 감지 플라 비 바이러스, 신흥 보건 위협이다. 현재, 백신은 인간의 사용 (1) 승인되지 않았다. 비 구조 (NS) (b) 단백질의 P38G 대체가 감쇠 웨스트 나일 바이러스 균주, 야생형 WNV NY99 변형이보다 마우스에는 마우스의 치사하지만 높은 타고난 사이토 카인 및 T 세포 반응을 유도하지 알려져있다. NS4B-P38G 돌연변이로 면역화 마우스는 모든 치명적인 야생형 웨스트 나일 바이러스와 보조 도전으로부터 보호했다. 이 NS4B-P38G 돌연변이 이상적인 백신 후보에 적합한 기능을 가지고 있음을 시사한다. NS4B-P38G 돌연변이가 높은 보호 후천성 면역을 유도하는 메커니즘은 명확하게 아직 이해되지 않습니다. 병원체 관련 분자 패턴을 인식 수신자 같은 수용체 (TLR에)는, 바이러스 감염에 대한 선천성 면역의 개시에 필수적인 역할을한다. 코어 TLR 신호 전달 경로가 골수 분화 일차 응답 GE를 이용기본 어댑터 3,4로 북동 88 (에서 MyD88). 최근 연구에서, 시그널링에서 MyD88 쥐 5 NS4B- P38G WNV 감염 중에 돌연변이 세포 성 면역의 개발에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 수지상 세포 (DCS)는 바이러스 감염시 -6,7- 차 T 세포 반응을 개시하는 독특한 능력을 나타내는 중요한 항원 제시 세포의 하나이다. CD4 + 및 CD8 + T 세포는 오랫동안 지속 면역 보호에 기여 야생형 WNV 감염 8,9 다음 숙주의 생존에 중요한 두. 두 면역 분석법 NS4B-P38G 돌연변이 감염된 마우스에서 이들 세포의 기능을 평가하기 위해 본 연구에 사용 하였다.
– / – 생쥐 먼저, 시험 관내 T 세포 프라이밍 분석법 WNV 감염 야생형에서 MyD88의 수지상 세포의 항원 제시 능력을 비교하기 위해 사용 하였다. 분석, 순진한 CD4 <의 감도를 높이려면CFSE (WNV 감염 마우스의 339 수지상 정제하고, 카르복시 숙신 부활절 공 배양 – SUP> + T 세포를 323 (OVA) 펩티드 닭 오브 알부민 대 Vα2 / Vβ5 TCR의 구체적인 표현 OTII 트랜스 제닉 마우스로부터 단리 하였다 OVA 펩티드의 존재 하에서) 표지 된 CD4 + T 세포. 공동 배양 5 일 후에, 세포를 수확하고, 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 증식 분석은 전통적으로, 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 삼중 또는 티민 deoxyriboside (3 HTdr) (10)의 혼입을 통해 이루어지고있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 분석은 방사성 및 / 또는 웨스트 나일 바이러스 연구가 진행되어 바이오 안전성 레벨 (BL) 3 시설에서 특수 장비를 필요로 하나 있습니다. CFSE가 더 일반적으로되어 면역 학적 검정에 매우 중요 사용한 염료의 형광 강도 반감 의한 일련의 림프구 증식 유세포 분석은 염료보다 안정적이기균등하게, 세포 내로 혼입 유동 세포 계측법에 의해 검출이 용이하고, 방사능이 11이다. 분석은 또한 세포 분열 횟수를 평가하는 기능을 갖는다. WNV 연구에서이 분석을 이용하여 하나의 큰 장점은 1 ~ 2 % PFA로 감염된 세포의 정착이 BL2 실험실에서 유세포 샘플 획득을 가능하게 WNV 12 비활성화 할 수 있다는 것이다.
다음에, 개질 된 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)가 절차에서 MyD88 NS4B-P38G 변이체 감염된 마우스에서 WNV 특정 T 세포 반응의 조절에 시그널링의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 이 분석에서, 감염된 마우스 비장 세포로부터 단리 WNV 특정 펩타이드 체외에서 처리 하였다. Brefeldin는 셀 내 사이토 카인을 유지하기 위해 첨가 하였다. 5 시간 배양 한 후, 세포를 수확하여 세척하고, T 세포의 서브 세트에 대해 염색 하였다. 이어서 세포, PFA 고정 투과 가능 인터페론 (IFN) -γ 스테인드 유세포 분석 하였다.세포를 고정 및 PFA를 포함하는 투과성으로 완충액으로 처리하면 다른 유동 세포 계측법 기반 분석과 마찬가지로, 감염된 샘플 추가 처리 및 분석을 위해 BL2 실험실로 전달 될 수있다. 여러 발표 된 연구에서, 우리는 웨스트 나일 바이러스에 감염된 쥐 13, 14에서 T 세포의 이펙터 기능을 측정하는 ICS를 사용했다. 이 잘 설립을했지만,이 분석의 한 가지 큰 단점은 절차가 매우 긴이며, BL3 시설 내에서 수행 할 때 소요되는 시간이 될 수 있다는 것입니다. 여기서, 마이크로 원심 분리 튜브 기반 ICS 방법보다, 실현 가능한 쉽게 진행하고 시간이 적게 BL3 실험실 내에서 수행 할 때 소요되는 것으로 나타났다.
Protocol
Representative Results
Discussion
웨스트 나일 바이러스는 BL3 병원체이다. 때문에 안전 규정, 웨스트 나일 바이러스에 감염된 샘플 면역 학적 분석은 종종 BL3 시설이나 수행이 더 길고 지루한에서 장비의 가용성에 의해 제한됩니다. 최근의 연구에서 우리는 웨스트 나일 바이러스 감염 5시 세포 매개 면역 반응을 연구하기 위해 두 개의 흐름 세포 계측법 기반의 방법을 사용했다. 모두 분석에서, 웨스트 나일 바이러스에 감?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
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