CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
De CRISPR / Cas9 systeem kan worden gebruikt om genomische deleties van een aantal formaten te genereren. Hoewel we hebben waargenomen dat de frequentie van deletie varieert omgekeerd met betrekking tot beoogde deletie grootte hebben we kunnen deleties tot 1 Mb, schrappingen terug tot 100 kb routinematig verkregen meerdere biallele verwijderd klonen. We hebben geen verlies in efficiëntie van sequentieel introduceren schrappingen in een cellijn waargenomen. Deze strategie kan worden gebruikt voor het maken van combinatorische deletie van talrijke genen en elementen. Het verkrijgen biallele deletie klonen kunnen worden versneld door schatting van het minimale aantal klonen moeten worden gescreend op basis schrapping grootte om het gewenste aantal klonen te verkrijgen met biallele deletie 12.
De mogelijkheid om monoallelische deletie met de afwezigheid van biallele deletie op probabilistische te bekomen kon cel letaliteit geassocieerd met volledig verlies van functie te geven. Lage frequency afwezig of deleties kunnen een aantal scenario's met slechte transfectie inefficiënt sgRNAs of inefficiënte PCR screening primers (bij gebrek aan een positieve controle voor PCR-primers valideren screenen voor verwijdering) weerspiegelen. GFP + cellen kunnen worden gebruikt als een surrogaat voor transfectie-efficiëntie (zie stap 5.2), dus een vermindering van GFP + cellen waarschijnlijk reflecteert slechte transfectie en een resulterende verminderde deletie efficiëntie. Met behulp van twee verschillende sgRNA paren met onafhankelijke screening primers kunnen helpen bij het controleren van inefficiënte sgRNA en screening PCR-primers en het maximaliseren van kansen op het verkrijgen biallelisch deletieklonen. Celsorteren voor GFP + cellen een verrijking voor verwijdering allelen. Hoewel deze stap kan worden weggelaten, zal nalaten waarschijnlijk noodzaken screening meer klonen die met monoallelische of biallelisch schrappingen identificeren. In de mate dat de transfectie-efficiëntie kan worden geoptimaliseerd, zouden we verwachten genoom bewerken efficiency worden verbeterd.
<p class = "jove_content"> De NHEJ gebeurtenissen die deleties en lokale reparatie resultaat grondslag liggen in een reeks allelen met verschillende INDELs op doelwitplaatsen. Het belangrijkste resultaat is klein ~ 1-10 bp inserties of deleties vaker op de plaats van sgRNA-gerichte splitsing (figuur 2B). Vaak lijken deze allelen het resultaat van microhomology gebaseerde reparatie 34,35 zijn. Opgemerkt zij dat de PCR gebaseerde detectie strategie beschrijven we niet groter of ingewikkelder inserties, deleties, inversies of herrangschikkingen identificeert. Hoewel deze gebeurtenissen komen minder vaak voor, hebben we klonen waarin noch verwijderen noch niet-deletie amplicons gedetecteerd konden worden waargenomen, en bij nader onderzoek weerspiegelen deze meer complexe uitkomsten.We hebben waargenomen uitgebreide CRISPR / Cas9 gemedieerde "littekens" niet-deletie allelen van monoallelische en niet-deletie klonen (zie figuur 2B). Deze "littekens" bestaan uitkleine INDELs geproduceerd in het sgRNA splitsingsplaats zonder de beoogde deletie (dwz deletie van het tussenliggende segment tussen sgRNAs A en B). Deze littekens onderbreken vaak doelwit erkenning door de sgRNA. Daarom willen wij u voorzichtig te dringen in retargeting allelen in cellen eerder zijn blootgesteld aan sgRNAs met dezelfde sgRNAs. Een meer succesvolle retargeting strategie zou uniek sgRNA gebruiken sequenties onderscheiden van vroeger "littekens" erkenning sites. In gevallen waarin een paar sgRNAs herkent exon sequenties (Figuur 1B, onder) kan leeskader allelen, zelfs bij afwezigheid van deletie geproduceerd. Daarom kan monoallelische deletieklonen worden verrijkt voor verlies-van-functie door de hoge frequentie van frameshift mutaties op het allel 12 niet-gewist.
Een zorg met de CRISPR / Cas9 systeem is off-target effecten, dat wil zeggen, genomische modificatie bij onbedoelde locaties 36-38. RECENTE rapporten hebben gesuggereerd dat korter gids RNA's met 17-19 nucleotiden van de frequentie van CRISPR kan verminderen / Cas9-based off-target effecten 39. Daarnaast kan een dubbel-nicking strategie met behulp van twee gidsen per doelgroep met een nickase worden gebruikt om DSB's maken terwijl het minimaliseren van off-target effecten 7. Alternatief, analoog aan strategieën voor RNAi, stellen we voor dat verschillende paren sgRNAs met niet-overlappende protospacer sequenties worden aangetoond dat het waargenomen fenotype is het resultaat van het betreffende target CRISPR / Cas9 wijziging in tegenstelling tot een mogelijke off-target effect. Een handige aanpak zou zijn om ten minste twee aangrenzende, maar niet-overlappende sgRNA paren zo te ontwerpen dat een enkele set van screening primers (zie stap 2) kan worden gebruikt voor meerdere sgRNA paren (Figuur 1A). Bovendien, als aanvulling op een deletie cellijn door de herinvoering van de ontbrekende volgorde en / of verstoorde gen kan een causaal verband tussen onderbouweneen bepaalde genomische deletie en fenotype.
Voor biologen werken met cellulaire modelsystemen, heeft RNAi een krachtig hulpmiddel voor functionele genomica vertegenwoordigd. Echter, de beperkingen van deze aanpak hebben opgenomen onvolledige reductie in target mRNA transcript niveaus, heterogeniteit van het effect van de onafhankelijke reagentia richten hetzelfde gen, en bekende off-target effecten waaronder zaad gebaseerd en niet-zaad effecten 40-42. Genoom bewerken strategieën beloven om veel van deze problemen aan te pakken en vertegenwoordigen een boeiende, complementaire aanpak voor potentiële genetische verstoring 8,36,37. Bovendien genoom bewerken maakt de studie van niet-coderende genetische elementen zodanig niet mogelijk RNAi en uitdagende conventionele benaderingen voor targeting 25. We moedigen generatie van genomische deleties door CRISPR / Cas9 als een robuust en specifieke methode om te produceren en te karakteriseren verlies-van-functie allelen.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |