Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Eiwit-eiwit interacties mediëren meeste processen in de levende cel en controle homeostase van het organisme. Verminderde eiwit interacties kunnen leiden tot ziekte, waardoor eiwit interacties belangrijke drug targets. Het is dus zeer belangrijk deze interacties op moleculair niveau te begrijpen. Eiwit interacties worden bestudeerd met verschillende technieken, variërend van cellulaire en biochemische assays kwantitatieve biofysische bepalingen en deze kan worden uitgevoerd hetzij met volledige lengte proteïnen, met eiwitdomeinen of peptiden. Peptiden dienen als uitstekende tools waarmee eiwit interacties te bestuderen omdat peptiden gemakkelijk kan worden gesynthetiseerd en laat de focus op specifieke interactie sites. Peptide arrays mogelijk zijn om de interactie plaatsen tussen twee eiwitten en het screenen op peptiden die het doelwit eiwit binden voor therapeutische doeleinden. Ze laten ook een hoge doorvoersnelheid SAR studies. Voor de identificatie van bindingsplaatsen, een getypeerdcal peptide matrix bevat meestal gedeeltelijk overlappende 10-20 resten peptiden afgeleid van de volledige sequenties van één of meer partnereiwitten van de gewenste doeleiwit. Screening van de array voor het doeleiwit bindende onthult de bindende peptiden overeenkomend met de bindingsplaatsen in de partnereiwitten, op een gemakkelijke en snelle manier met slechts kleine hoeveelheid eiwit.
In dit artikel beschrijven we een protocol voor het screenen van peptide-arrays voor het in kaart brengen van de interactie plaatsen tussen een target eiwit en haar partners. Het peptide array is ontworpen op basis van de sequenties van de partner eiwitten rekening houdend met hun secundaire structuren. De arrays gebruikt in dit protocol waren Celluspots arrays bereid door Intavis Bioanalytisch Instruments. De array wordt geblokkeerd aspecifieke binding en vervolgens geïncubeerd met het onderzochte eiwit te voorkomen. Detectie met behulp van een antilichaam blijkt de binding peptiden die overeenkomen met de specifieke interactieplaatsen tussen de eiwitten.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties mediëren meeste processen in de levende cel. Verminderde eiwit interacties kunnen leiden tot ziekte, waardoor eiwit interacties belangrijke drug targets. Het is dus zeer belangrijk deze interacties op moleculair niveau te begrijpen. Eiwit interacties worden bestudeerd met verschillende technieken, variërend van cellulaire en biochemische assays kwantitatieve biofysische bepalingen en deze kan worden uitgevoerd hetzij met volledige lengte proteïnen, met eiwitdomeinen of peptiden. Peptiden dienen als uitstekende tools waarmee eiwit interacties te bestuderen. Dit is omdat peptiden gemakkelijk worden gesynthetiseerd en laat het richten op een specifieke interactie plaats enerzijds en meerdere targets in high throughput wijze anderzijds 1,2. Peptide matrix screening is een snel, gemakkelijk te voeren werkwijze voor het verkrijgen van een grote hoeveelheid gegevens over de interactie van een doeleiwit met talrijke partners in korte tijd 3. In tegenstelling tot andere biochemische of biofysische werkwijzen voor het detecteren en analyseren van eiwit-eiwit interacties, peptide matrix screening vereist een zeer lage concentratie van eiwit en kan detecteren zeer zwakke binding. Peptide arrays kunnen worden gebruikt voor vele toepassingen in peptide-eiwit interacties, zoals in kaart brengen van eiwit-eiwit of receptor-ligand interactie plaatsen 4, homo- of hetero-oligomerisatie interfaces, karakteriseren antilichamen epitopen 5, bestuderen enzymactiviteiten 6 en high throughput structuur- activiteit (SAR) bestudeert 7. Voor een diepgaande review over peptide-array screening zie Katz et al. 4
Verschillende soorten peptide arrays momenteel bestaan. Er zijn twee belangrijke synthetische strategieën om peptide arrays: synthese van de peptiden voordat ze aan de vaste drager, of synthese van peptiden direct aan de vaste drager, meestal via de SPOT techniek 4,8. Hetpeptiden gesynthetiseerd op vaste drager gewoonlijk met 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) chemie 8. Onder de gemeenschappelijke synthetische schema zijn peptide bevestiging via de N-terminus (bijv JPT Pepstar arrays 9) en peptide bevestiging via de C-terminus (bijv PEPSCAN pepchip arrays 10, JPT pepspot arrays 9 en Intavis celluspot arrays 11) 4. De vaste drager kan variëren en dus ook de chemie van het peptide koppeling aan. Cys eindigende peptiden kunnen via de thiolgroep 12 worden bevestigd aan glasplaatjes. De N terminus van een peptide covalent gebonden aan een hydroxylgroep op het cellulose membraan door verestering van het aminozuur bevestigd 8.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van peptide arrays als een methode voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties. De matrix we gebruikten de Celluspots array, die een micro-array met grote amount plekken (duplicaten tot 384 spots) op een kleine cellulose membraan ondersteund door een glasplaatje. Dit maakt het werken met lage hoeveelheden eiwitten en antilichamen en het verkrijgen van aanzienlijke hoeveelheid data per afzonderlijk experiment. Deze array bevat ook een hoge dichtheid peptide dat detectie van lage affiniteit binden toelaat. De matrix werd gebruikt voor het afbeelden van de STIL-CHFR interactie, die zeer belangrijk is voor het regelen van normale celproliferatie 13. Ongecontroleerde interactie tussen de twee eiwitten kan leiden tot de ontwikkeling van kanker. Door het in kaart brengen van deze interactie vonden we de specifieke bindingsplaats en bindende residuen 14. Dit maakt de weg vrij voor het ontwerpen van een rationele remmers dat deze interactie eiwit-eiwit te remmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peptide-array screening is een uitstekend hulpmiddel voor het identificeren van de bindingsplaatsen van een doelwit eiwit in haar partners. Deze test is gemakkelijk uit te voeren en de resultaten kunnen worden verkregen in één of twee dagen. Peptide matrix screening is veelzijdig en kan worden gebruikt voor vele doeleinden. Het kan gebruikt worden voor het karakteriseren na translatie modificaties zoals fosforylering en substraten te identificeren van kinasen. Bijvoorbeeld: de FLT3 kinase, die gerelateerd is aan acute…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF werd ondersteund door een starting grant van de European Research Council onder het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (FP7 / 2007-2013) / ERC Grant overeenkomst n ° 203413 en door de Minerva Centrum voor Bio-hybride complex systems.HA en AI worden ondersteund door de Dalia en Dan Maydan Fellowship voor geavanceerde graad studenten aan de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
