El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
Las células derivadas de fuentes perinatales, como la placenta, membranas de la placenta, el cordón umbilical y el líquido amniótico han atraído la atención de investigadores y clínicos como una fuente potencial de células para la medicina regenerativa 1,2. La razón de este interés es que todos estos tipos de células poseen un cierto grado de plasticidad y capacidad inmunomoduladora 3, propiedades que son fundamentales para sus aplicaciones terapéuticas potenciales.
HAECs son una población heterogénea epitelial que se puede derivar de plazo o pre-término membrana amnios 4, proporcionando una abundante fuente potencial de material celular regenerativa. Las propiedades que hacen que HAECs atractivos como una terapia celular incluyen su multipotencia, baja inmunogenicidad, y las propiedades anti-inflamatorias. HAECs se han encontrado para ser altamente multipotentes tanto in vitro como in vivo, capaces de diferenciarse en linajes mesodérmicos (cardiomyocytes, miocitos, adipocitos, osteocitos), de origen endodérmico (células pancreáticas, células hepáticas, células pulmonares) y linajes ectodérmicas (pelo, piel, células neuronales y astrocitos) 5-10.
De modo tranquilizador, a pesar de sus HAECs multipotencialidad no parecen bien forman tumores o promueven el desarrollo de tumores in vivo. Además, HAECs también son inmunes privilegiados, que expresa bajos niveles de antígenos de clase II leucocitarios humanos (HLA) 8. Esta propiedad probablemente subyace en su capacidad para evadir el rechazo inmunológico después del trasplante alogénico y xenogénico, como se demuestra en los estudios que utilizaron monos inmunes competentes, conejos, cobayas, ratas y cerdos 11-13. HAECs mostrar inmunomodulador potentes propiedades inmunosupresoras y por lo tanto ofrecen ventajas prácticas significativas para potenciales aplicaciones clínicas en el tratamiento de la enfermedad autoinmune. HAECs se cree que ejercen funciones inmunomoduladoras tanto en el sistema inmune innata y adaptativa. Ene de los mecanismos sugeridos, es a través de la secreción de factores inmunomoduladores 14.
Las aplicaciones actuales de HAECs en modelos de enfermedades de animales pre-clínicos incluyen el tratamiento de apoplejía, esclerosis múltiple, enfermedad hepática, diabetes y enfermedades pulmonares crónicas y agudas. Los investigadores han mostrado interés en utilizar HAECs para tratar posterior al accidente cerebrovascular inflamación cerebral debido a sus propiedades únicas. Hay evidencia de que HAECs puede cruzar la barrera de sangre del cerebro donde pueden injertarse, sobrevivir durante hasta 60 días, de diferenciarse en neuronas, disminuir la inflamación y promover la regeneración del tejido nervioso central dañado sistema en modelos animales de enfermedades neurológicas 15.
HAECs ofrecen la posibilidad de dirigir e invertir múltiples vías patológicos que contribuyen al desarrollo y la progresión de la esclerosis múltiple. Por ejemplo, los resultados de estudios en animales pre-clínicos sugieren que HAECs son fuertemente inmunosupresora ypuede potencialmente inducir tolerancia inmune periférica y revertir las respuestas inflamatorias en curso. HAECs también se han demostrado tener la capacidad de diferenciarse en células neuronales in vivo y mejorar la neuroregeneración endógena a través de la secreción de una amplia gama de factores neurotróficos 16.
Células epiteliales humanas y amnios roedor ya han demostrado su eficacia terapéutica para el tratamiento de la enfermedad hepática en modelos animales. En un modelo de daño de inducción tetracloruro de carbono de la enfermedad hepática, haec trasplante de plomo para el injerto de HAECs viables en el hígado, acompañada con una reducción de la apoptosis de hepatocitos, y la disminución de la inflamación y la fibrosis hepática 17.
HAECs se puede estimular a los factores de páncreas expresadas incluyendo insulina y glucosa transportistas. Varios estudios han investigado el potencial de HAECs para restablecer los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos 18. En los ratones que recibieronHAECs, tanto a nivel de peso y glucosa en la sangre del cuerpo de los animales disminuyó a niveles normales después de la inyección de las células. Estos estudios presentan un caso fuerte para el uso de HAECs para el tratamiento de la diabetes mellitus.
HAECs tienen un papel demostrado en la prevención y reparación de la lesión pulmonar aguda y crónica experimental, tanto en adultos y neonatales 19 modelos. Estos estudios encontraron que HAECs diferencian in vitro en células epiteliales del pulmón funcional que expresan múltiples proteínas pulmonares asociadas, incluyendo la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR), el canal iónico que está mutado en pacientes con fibrosis quística 20. Además, cuando HAECs se entregan al adulto lesionado y pulmonar neonatal, que ejercen sus efectos a través de la modulación de reparación de las células inmunitarias del huésped, reduciendo el reclutamiento de leucocitos pulmonar, incluyendo neutrófilos, macrófagos y linfocitos 21-23.
Dada su abundancia,historial de seguridad y aplicaciones clínicas probadas para varias enfermedades, los ensayos clínicos utilizando HAECs es inevitable. Con el objetivo de acelerar la traducción de terapias HAEC a de ensayos clínicos, hemos desarrollado métodos para aislar, criopreservar y HAECs cultura de una manera adecuada para los ensayos clínicos, el uso de reactivos a productos libres de animales de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) directrices .
Basamos este protocolo un protocolo previamente publicado que estábamos usando con éxito para aislar HAECs utilizando reactivos de origen animal 6. Hemos modificado el protocolo original para reemplazar productos de origen animal con reactivos de productos libre de animales, y la optimización posterior se realizó para optimizar el rendimiento de células, la viabilidad y pureza. Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo que cumplir con las normas reglamentarias para la fabricación de células para los ensayos clínicos en humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios parámetros críticos que pueden tener un impacto significativo en el éxito de esta metodología. El almacenamiento de la placenta o el amnios para hasta 3 horas antes del aislamiento de HAECs puede ser deseable para fines logísticos o de programación, sin embargo se recomienda que el tejido se procesa tan pronto como sea posible. Si el tejido se va a almacenar, se recomienda que se realice el almacenamiento después de la disección y el lavado de la membrana amnios. Amnion se puede almacenar en HBSS que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. . Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. . Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).
