Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur
Summary
In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.
Abstract
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung der akuten Hirnschnitten. Dieses Verfahren ist ein kritisches Element für elektrophysiologische Patch-Clamp-Experimenten, die weitgehend die Qualität der Ergebnisse bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass das Weglassen der Kühlschritt während des Schneidverfahrens ist vorteilhaft beim Erhalt gesunder Scheiben und Zellen, insbesondere beim Umgang mit hoch myelinisierten Hirnstrukturen aus reifen Tieren. Obwohl der genaue Mechanismus, durch erhöhte Temperatur unterstützt neuronalen Gesundheit kann nur spekuliert werden, liegt es nahe, daß, wenn möglich, die Temperatur in dem das Schneiden durchgeführt wird, sollte in der Nähe von physiologischen Bedingungen, um temperaturbedingte Artefakte zu vermeiden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist die Einfachheit des Verfahrens und damit die kurzen Vorbereitungszeit. In der Methode nachgewiesen erwachsenen Mäusen werden verwendet, aber die gleiche Prozedur kann mit jüngeren Mäusen als auch Ratten angewendet werden. Auch die folgenden Patch clamp Experiment auf horizontalen Kleinhirnschnitten durchgeführt, aber die gleiche Prozedur kann auch in anderen Ebenen als auch andere hinteren Bereichen des Gehirns verwendet werden.
Introduction
Das Ziel der vorgestellten Methode ist es, qualitativ hochwertige akuten Hirnschnitten für die in vitro elektrophysiologischen Experimenten bekommen, vor allem bei der Verwendung von Erwachsenen oder sogar alte Tiere.
Die akute Hirnschneidverfahren, wie von Skrede und Westgaard 1 in zwei eleganten Sätzen beschrieben, hat sich zu einer der Grundlagen der modernen neurowissenschaftlichen Forschung und wird weltweit in unzähligen Variationen beschäftigt. Die Qualität der Schichten wird in der Anzahl der lebenden Neuronen pro Schicht reflektiert wird, die Zeitdauer, während welcher die Zellen behalten ihre elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften als auch die Integrität des Gewebes. Außerdem ist die maximale Dauer für einen stabilen Aufzeichnungen hängt von der Qualität der Schichten. Somit entlang der Jahrzehnte die ursprüngliche Schneidverfahren wurde weiter von einzelnen Forschungsgruppen entwickelt Scheibe Erholung nach dem Schneiden 2-10, die durch komplexe Modifikationen der Zusammensetzung der Schneide erweitern or Recovery-Lösungen (wie Hinzufügen Ascorbat, Thioharnstoff oder auch H 2 O 2) als auch intrakardiale Perfusion vorge des Tieres mit gekühlten physiologischen Lösungen.
Wie kürzlich gezeigt, 11 scheint physiologischer Temperatur während des Schneidens als vorteilhafter als Kühl neuronale Gesundheit; die Verbesserung ist auffälligsten bei der Arbeit mit Erwachsenen (2-8 Monate) Nagetiere. Vermeidung dramatische Temperaturänderungen verhindert Artefakte aufgrund von temperaturabhängigen Prozesse in den Zellen, wie Plastizität 13 und Ionenkanäle Kinetik 13,14. Solche Änderungen können Membranspannung und der intrazellulären Calcium-Signalgebung, spitze Schwelle beeinflussen, und Spike Form.
Die "heiße" akute Schnittpräparat hier vorgestellte Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zur Gewinnung hochwertiger akuten Hirnschnitten von jeder Region des Gehirns, einschließlich des Kleinhirns, die Cortex und Hippocampus, Hirnstammkerne 16 </ Sup> und Riechkolben, die beide in Ratten und Mäusen.
Bemerkenswert ist, erfordert die physiologische Temperatur Slicing Verfahren, dass die Schneidklinge schwingt nahezu perfekt horizontal und ist ohne bauliche Mängel. Eine solche Präzision vielleicht nicht erreichbar mit älteren Slicer Modelle; In solchen Fällen empfehlen wir die Durchführung der Schnittpräparat in eiskalten Bedingungen wie die niedrige Temperatur scheint das Gewebe widerstandsfähiger gegen mechanische Beschädigungen, auch wenn auf Kosten der Stoffwechselfehler zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir zeigen ein Verfahren zur Herstellung von akuten Gehirnschnitten von Mäusen in physiologischer statt eiskalter Temperatur.
Es wurde gezeigt, dass 11 die Qualität der Scheiben in warmen Bedingungen erhaltenen überlegen ist, wenn sie mit denen mit kalten Bedingungen hergestellt verglichen, vorausgesetzt, daß die Schneidklinge eine minimale vertikale Vibration. Slicing in physiologischer Temperatur können physiologische Artefakte durch die niedrige Temperatur verursacht werde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg / ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. . The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
