Xenopus laevis embriyoların hastanın ağız boyutunu ve şeklini ölçmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol, geleneksel boyutu ölçümleri, hastanın ağız geliştirme ve kusur daha sofistike analizlerine olanak sağlamak için geometrik morfometrik ile birleştirilir.
Xenopus kraniyofasiyal gelişimi ve kusurları yöneten mekanizmaların diseksiyon için önemli bir araç haline gelmiştir. Orofasyal gelişimini ölçmek için bir yöntem olup, genetik veya moleküler gen ekspresyonunu ve protein işlevini değiştirmek mümkün olan maddeler ile kaldırılması üzerine orofasial fenotipleri daha titiz analizi için izin verir. Embriyonik başkanlarının iki boyutlu görüntülerini kullanarak, geleneksel boyutların-gibi orofasyal genişlik, yükseklik ve alan-ölçülür. Buna ek olarak, embriyonik ağız açıklığı bir yuvarlaklık ölçü ağız şeklini tarif etmek için kullanılır. Bu iki boyutlu görüntü Geometrik Morfometri da oral bölgede şeklindeki değişiklikler arasında daha sofistike bir görünüm temin etmek üzere gerçekleştirilir. Merkezi orofasial bölgedeki belirli noktalara atanan ve koordinatlar oluşturulur. Bir ilke bileşen analizi, daha sonra tedavi ayrımcılık ilkesi bileşenleri dönüm koordinatları azaltmak için kullanılırgrupları. Bu sonuçlar benzer orofasiyal şekilleri ile bireylerin birlikte küme hangi bir dağılım grafiği olarak gösterilir. Ayrıca istatistiksel olarak iki tedavi grubu arasındaki yerlerinden pozisyonlarını karşılaştıran bir diskriminant fonksiyon analizi yapmak için yararlıdır. Bu analiz, dönüm pozisyonda değişiklikler vektörler olarak görülen bir transformasyon ızgara üzerinde gösterilir. Bir ızgara, bir eğirme düzeni önemli bir merkezi nokta pozisyonları değişti yeri göstermek için görüntülenen ve böylece bu vektörlerin bindirilir. Ayırt edici fonksiyon analizinde, şekil değiştiren bir istatistiksel ölçüme dayanmaktadır ve bu nedenle, bir p-değeri ile değerlendirilebilir. Bu analizi sadece bir Stereoskop ve ücretsiz bir yazılım gerektirmeden, basit ve erişilebilir ve böylece değerli bir araştırma ve öğretim bir kaynak olacaktır.
Insan doğum defektleri en sık ve yıkıcı türleri arasında böyle orofasial yarıkların 1 olarak ağız ve yüz etkileyen olanlardır. Malforme orofasiyal yapıları ile çocukların yaşamları boyunca birden fazla ameliyat geçiren ve yüz disfigurements, konuşma, işitme ve yeme sorunları ile mücadele. Bu nedenle, Kranyo- ve orofasyal gelişiminde yeni araştırmalar kolaylaştırmak insanlarda doğum kusurları bu tür önlenmesi ve tedavisi için çok önemlidir. Xenopus laevis kraniofasyal gelişimi yöneten mekanizmalar diseksiyon için yeni bir araç olarak ortaya çıkmıştır (bazı örnekler 2,3,4 dahil -11). Bu nedenle, bu türün baş geliştirme ve yüzü boyunca boyut ve şekil değişiklikleri analiz etmek için bir miktar belirleme yöntemi 3 çok güçlü olabilir.
Burada, biz böyle bir yöntem mevcut; Bir Xenopus çalışmada 12 uyarlanmıştır geometrik morfometrik geleneksel boyut ölçümlerinin bir araya getirilmesiyle </İnsan yüz formu 13-15 analiz eden çalışmaların sup> ve bir servet. Bu protokolün amacı, araştırmacılar, normal ve anormal gelişim sırasında farklı orofasial fenotipleri arasında ayrım yüz boyut ve şekil ölçmek için izin vermektir. Bu analiz, genler ve / veya çevresel faktörlerin sinerjistik etkilerinden kaynaklanan bu gibi ince kraniofasyal kusuru arasındaki farkı daha iyi sağlayacaktır. Ayrıca, bu ölçme yöntemi de orofasial kusur bile hafif bir iyileşme veya kurtarma ortaya koyabilir. Bu nedenle muhtemel terapötik analiz etmede yararlı bir rehber yapar.
Sunduğumuz yüz ölçümleri ve geometrik morfometrik kombinasyonu genelde sadece bir ya da diğer 15-18 kullanmak büyüklüğü ve mevcut protokoller daha orofasial bölgenin şekli hem daha kapsamlı istatistiksel analiz sağlar. Ayrıca, biz medial ve lateral uçakları hem değerlendirmek için basit bir yol sunmakmevcut çalışmalarda 13,19 kullanılan gelişmiş üç boyutlu görüntüleme ekipmanı gerektirmeden yüzü.
Biz Xenopus Bu protokol anormal orofasial geliştirme ve bir orta yarık damak 2,3 oluşturan bir retinoik asit reseptörü inhibitörü ile işlemden geçirildi embriyolar laevis göstermektedir. Bu embriyolar oral bölgede boyutları ve şekli Niceleme içindeki damak yarıkları ve fare modellerinde 20,21 insanlarda benzer olan orta yüz değişiklikler açığa çıkarmıştır. Bununla birlikte, bu protokol, örneğin büyüme faktörleri gibi doğal maddeler, herbisitler, veya proteinler gibi orofasyal geliştirilmesi için diğer bileşiklerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Bundan başka, kayıp ya da fonksiyon deneylerinin kazancı ile gen ekspresyonunun pertürbasyon kaynaklanan orofasial boyut ve şekil değişiklikleri, (antisens morpholinos veya Crispers kullanarak / Talens) da bu protokol kullanılarak tayin edilebilir. Son olarak, bu yöntem, karakteristiklerin geliştirilenLly Xenopus morfolojisi değerlendirilmesi; Bununla birlikte, kolaylıkla bir omurgalının analizi için modifiye edilir. Diğer uygulamalar da evrimsel ve ekolojik çalışmalar için yakından ilişkili türlerin karşılaştırıldığı için bu protokolü kullanarak içerebilir. Burada temin örneğin oral bölgede analizini tarif etmek için bu protokolü kullanır iken, kolaylıkla diğer bölgelerde, organlarda ya da yapıların analizi için modifiye edilebilir.
Bu orofasial ölçümü protokol araştırma toplum için değerli bir kaynak, hem de bir video gösterisi olarak lisans öğrencileri için mükemmel bir eğitim aracı olacaktır.
Xenopus laevis gelişimsel altında yatan mekanizmaları orofasial gelişimini diseksiyon için yararlı bir araç haline gelmiştir; Ancak, kurbağa bu bölgenin büyüklüğü ve şekli değişiklikleri açıklayan hiçbir protokoller vardır şu anda. Burada anlatılan yöntemi Xenopus'ta ve diğer omurgalıların orofasial fenotip daha titiz ölçümü için izin vererek orofasial kalkınma alanında önemli bir katkı sağlayacaktır.
Uygun şekilde bu protokolü y…
The authors have nothing to disclose.
VCU A. Dickinson start-up paraları bu çalışmaları destekledi.
Yazarlar şematik Çizdikten onun sanatsal yetenek için Dan Nacu kabul etmek istiyoruz.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
BMS-453 | Tocris | 3409 | |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
100% Ethanol | VWR | 89125-170 |