Rétine neurale d'une souris âgée de 8 jours est au-dessus d'un bloc de gélatine de 4%. Après isolement de la couche de photorécepteur (200 um) par vibratome, les photorécepteurs sont ensemencées après dissociation mécanique et enzymatique de la culture. La couche de photorécepteur peut être utilisé pour des analyses biochimiques ou la transplantation moléculaires.
La rétine est une partie du système nerveux central qui est organisé architecture, avec des couches de neurones dans les photorécepteurs, les bâtonnets et les cônes sont en contact avec l'épithélium pigmentaire de la rétine dans la partie la plus éloignée sur la rétine en considérant le sens de la lumière, et la cellules ganglionnaires de la distance la plus proximale. Cette architecture permet l'isolement de la couche de photorécepteur par sectionnement vibratome. La rétine neurale disséqué d'une souris âgée de 8 jours est plat intégré dans 4% de gélatine sur le dessus d'une tranche de 20% couche des photorécepteurs de gélatine vers le bas. En utilisant un vibratome et une lame de rasoir à double tranchant, l'épaisseur rétine interne 100 um est sectionné. Cette section contient les cellules ganglionnaires et la couche interne avec notamment les cellules bipolaires. Une section intermédiaire de 15 um est jeté avant 200 um de la rétine externe contenant les photorécepteurs est récupéré. La gélatine est éliminé par chauffage à 37 ° C. Des morceaux de couche extérieure sont incubaTed dans 500 pi de la solution de Ringer avec 2 unités de papaïne activée pendant 20 min à 37 ° C. La réaction est arrêtée par addition de 500 ul de 10% de sérum de veau foetal (FCS) dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), puis 25 unités de DNase I est ajouté avant la centrifugation à la température ambiante, on le lave plusieurs fois pour éliminer le sérum et les cellules sont remises en suspension dans 500 pl de DMEM et ensemencées à 1 x 10 5 cellules / cm 2. Les cellules sont cultivées à 5 jours in vitro et leur viabilité classé par dosage vivants / morts. La pureté de la culture est tout d'abord déterminée par observation au microscope pendant l'expérience. La pureté est ensuite validé par le semis et la fixation des cellules sur une lame et l'analyse histologique en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-affaissement, un marqueur de photorécepteur et monoclonal de souris anti-Rho, un marqueur spécifique tige de photorécepteur. En variante, la couche de photorécepteur (97% des tiges) peut être utilisé pour l'analyse génétique ou l'expression des protéines et pour la transplantation.
La rétine est une partie intégrante du système nerveux central qui présente une architecture conservée chez les vertébrés. Les neurones de la rétine neurale sont organisés en couches, avec le plus éloigné de la lumière incidente, la couche de photorécepteur en contact étroit avec l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l'arrière de l'œil. Bâtonnets et des cônes photorecptors sont des cellules sensibles à la lumière qui se appuient sur des molécules sensibles opsin pour la capture des photons. Ces molécules sont jointes sur des membranes de disque d'une structure alvéolaire, situé sur le segment externe du photorécepteur qui pointe dans la direction de l'EPR 1. Cette structure, qui est le plus souvent touché très tôt dans les cas de dégénérescence des photorécepteurs, est renouvelé au taux de 10% tous les jours. La couche dite interne contient la plupart des autres neurones qui calculent le signal reçu en provenance des photorécepteurs, les bipolaires, amacrines et de cellules horizontales ainsi que les cellules ganglionnaires. Ces derniers avec leurs axonesformer un faisceau qui est le nerf optique. Cette superposition est donc conservé que les biologistes ont utilisé le terme déplacées cellules amacrines lorsque les cellules se trouvent en dehors de la couche interne plexiforme 2. Couches de neurones sont répartis au sein d'une armature des cellules gliales radiales Müller. Cellules bipolaires lien photorécepteurs aux cellules ganglionnaires. Elles sont situées entre la couche plexiforme externe et la couche plexiforme interne. Les cellules ganglionnaires forment la couche plexiforme interne en relation avec les cellules bipolaires. Les cellules amacrin sont nommés comme des cellules d'association situés dans la couche plexiforme interne entre les cellules bipolaires et les cellules ganglionnaires. La couche plexiforme externe contient des cellules horizontales. Cet arrangement unique de couches neuronales du système nerveux central permet l'isolement de la couche photoréceptrice de la couche cellulaire interne par tranchage de la rétine à plat monté en utilisant un vibratome.
À l'origine, cette technique a été utilisée pour isoler photorécepteurs pour transplantation dans l'oeil de la souris rd1, un modèle de la rétinite pigmentaire humaine (RP) 3. La souris rd1 porte une mutation dans le gène récessif PDE6B qui code pour la sous-unité bêta de la phosphodiestérase spécifique de tige. Mutations récessives de ce résultat de gène dans RP chez les humains 4. Après photorécepteurs ont dégénéré en forme de tige, le patient perd la vision de nuit, de façon surprenante et photorécepteurs de cône, qui ne expriment pas le gène muté, dégénèrent en tant que seconde étape. Parce que les cônes sont nécessaires pour la vision des couleurs et l'acuité visuelle, les patients deviennent progressivement aveugle et un traitement efficace de la maladie n'a pas encore développé. En greffant couche des photorécepteurs d'une souris de type sauvage la dégénérescence de cône de la souris hôte est retardée 3,5. Les tiges perdus dans le modèle de dégénérescence tige-cône ne pourraient être remplacés par une greffe parce que la connexion synaptique entre les tiges et les cellules bipolaires ne peut être obtenue à un stade spécifique de retinal développement, marqué par l'apparition de Nrl expression 6. La couche de photorécepteurs est introduit par chirurgie dans l'espace sous-rétinien de la rétine RD1 moins de tige, entre le RPE et la rétine externe correspondant à seulement 3% des photorécepteurs restants, les cônes. Deux semaines après la chirurgie, 40% des cônes de l'animal transplanté d'une couche photoréceptrice a survécu à la normale par rapport à l'animal transplanté d'une couche de cellules de la rétine normale intérieures ou à l'animal pseudo-opérées. La topographie de la survie de cône, étalée sur toute la surface de la rétine mutée situé à la position du tissu greffé indique que l'effet protecteur est due à une molécule diffusible 7.
Ensuite, nous avons utilisé un système de co-culture, ainsi que des milieux de culture conditionnés pour valider le fait que l'effet protecteur se appuie sur la sécrétion d'une protéine par des tiges 8,9. Nous émettons l'hypothèse que cette protéine sera exprEssed en continu et en particulier par des tiges et que leur mort au cours de la première phase de la maladie va déclencher la dégénérescence du cône secondaire par la perte d'un signal de protection à partir de tiges de manière autonome sans cellule 10. En raison de l'importance de cône médiation vision centrale chez les primates cette protéine putative sera un outil thérapeutique très pertinent pour RP. Préserver les cônes dans RP serait théoriquement empêcher un total de 1,5 millions de patients du monde entier à devenir aveugle 11. Nous avons utilisé une approche de dépistage teneur élevée et un modèle de culture de cône enrichi à identifier un ADNc codant Cone Rod dérivés viabilité Factor (RdCVF) à partir d'une banque d'ADNc de la rétine 12. RdCVF est le produit épissé du gène NXNL1 qui est intéressant homologue au gène codant pour des protéines analogues à la thiorédoxine impliqués dans l'homéostasie redox 13. Le deuxième produit épissé du gène, RdCVFL est une enzyme qui protège sa cible, la protéine tau contre la dégradation oxydative dAmage 14. L'administration de RdCVF empêche la dégénérescence secondaire des cônes et la perte de leur fonction visuelle dans un récessif, et le modèle dominant de RP 12,15. Cela démontre deux aspects importants de cette stratégie thérapeutique innovante 16. En premier lieu, elle peut être appliquée dans la plupart des cas de RP dans un gène de manière indépendante. Deuxièmement, contrairement au facteur concurrence survie CNTF, RdCVF est associée avec le maintien de la fonction visuelle 17. L'absence de l'effet fonctionnel peut expliquer la raison de l'absence de bénéfice clinique de l'administration de CNTF aux patients atteints de RP 18. RdCVF est probablement l'un du signal de survie importante entre les bâtonnets et les cônes depuis cône sauvetage in vitro est inhibée par 12 RdCVF immunodéplétion. En outre, la disruption du gène cône viabilité tige dérivé conduit à un dysfonctionnement photorécepteur et la sensibilité au stress oxydatif 19.
L'utilisation decouche photoréceptrice est à l'origine de l'identification de RdCVF et d'un signal de nouveau redox impliqués dans des maladies neurodegeneratives 20. Ce manuscrit décrit le protocole utilisé pour isoler et cultiver des cellules de la couche de photorécepteur pour caractériser l'activité de RdCVF. Les photorécepteurs peuvent être maintenues en culture pendant 5 à 7 jours 21. Cette technique peut également être utilisée pour étudier l'expression de gènes spécifiques de photorécepteur.
La rétine est un organe de modèle en biologie. Étude de la rétine a conduit à six grandes découvertes en biologie. Il est à l'origine du premier gène suppresseur de tumeur RB1. Il révèle la liaison moléculaire entre les tyrosine kinases de récepteur et les MAP kinases par l'interaction avec Fils de sevenless. Il a été impliqué dans la découverte de PAX6, le premier gène de commande maître pour la morphogenèse d'organes. Il est au centre de l'association génétique du facteur de complément H (CFH) à la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), le premier gène de susceptibilité à la maladie identifié par écran large génome d'association (GWAS). Enfin, il a conduit à la première thérapie génique réussie pour amaurose congénitale de Leber, le premier essai de thérapie génique chez l'homme correctives de toute maladie héréditaire. La structure de cet organe est conservée dans la plupart des espèces de vertébrés. Son accessibilité pour la manipulation in vivo a encouragé dès le début de génomique fonctionnelle des enquêtes sur cette partie intégrante du central système nerveux.
Nous montrons ici comment séparer la couche de photorécepteur à partir de la couche interne de la rétine par sectionnement vibratome. Cette étape est essentielle pour obtenir des cultures pures de photorécepteur. Notre protocole de dissection rend la contamination par des cellules RPE très peu probable.
L'un des principaux défis est l'aplatissement de la rétine qui est nécessaire à la section correctement l'intérieur et la rétine externe. Le sectionnement de la rétine est préférable de rétine avec un petit diamètre que ceux des rongeurs et ce diamètre est une limitation de la technique avec des matériaux actuellement disponibles.
Il est recommandé avant de commencer une expérience biologiquement significative, à pratiquer sur un échantillon de la rétine. Nous illustrons la méthode par des résultats représentatifs obtenus à partir de cellules photoréceptrices de culture, en utilisant le matériel pour effectuer l'étude de l'expression des deux ARNm et des protéines. Des études d'expression peuvent également être réalisées en variante sur sections obtenus par microdissection laser, mais les cultures sont réalisées en utilisant mieux vibratome sectionnement. Nous aurions pu utiliser la technique de microdissection laser avec une stratégie complètement différente. Mais, pour collecter la couche de photorécepteur avec le dispositif de microdissection pour la culture, il serait nécessaire d'éviter fixateur et cela compliquerait sensiblement la méthodologie actuelle.
Nous développons un protocole visant à étudier la cinétique de l'expression génique et protéique dans vibratome sections au cours de la dégénérescence des photorécepteurs dans les modèles de la rétinite pigmentaire. Nous croyons que la description détaillée du protocole sera utile aux chercheurs dans le domaine de la biologie de la rétine, et tout particulièrement pour les études protéomiques et métabolomiques.
The authors have nothing to disclose.
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
Scissor | Moria | 15396-00 | |
Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
* Supplements |