A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação.
Enucleação ou a remoção cirúrgica de um olho pode ser geralmente considerado como um modelo para deaferentação nervo. Ele fornece uma ferramenta valiosa para estudar os diferentes aspectos do visual, cross-modal e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos 1-4.
Aqui, demonstramos uma técnica elegante e simples para a remoção de um ou ambos os olhos no rato, que é validado em ratinhos de 20 dias de idade até adultos. Resumidamente, um desinfectadas pinças curvas é utilizado para fixar o nervo óptico atrás do olho. Subsequentemente, os movimentos circulares são realizadas para comprimir o nervo óptico e retirar o globo ocular. As vantagens desta técnica são de alta reprodutibilidade, o mínimo de sangramento, recuperação pós-operatória rápida e um limiar de aprendizagem muito baixo para o experimentador. Assim, uma grande quantidade de animais pode ser manipulado e processado com uma quantidade mínima de esforço. A natureza da técnica pode induzir danos ligeiros ada retina durante o procedimento. Este efeito secundário torna este método menos adequado em comparação com Mahajan et al. (2011) 5, se o objetivo é coletar e analisar tecido da retina. Além disso, o nosso método é limitado a pós-olho abrindo as idades (rato: P10 – 13 em diante) desde o globo ocular precisa ser deslocado do soquete sem a remoção das pálpebras. A técnica in vivo enucleação descrito neste manuscrito foi recentemente aplicado com êxito com modificações menores em ratos e parece útil para o estudo da via visual aferente de roedores em geral.
Remoção de um olho e, assim, de forma irreversível destruindo a superfície receptor sensorial (retina), impõe uma perda considerável de informações sensoriais ao longo da via visual. O modelo de enucleação no sistema visual juvenil e adulta tem provado ser valiosos para compreender o desenvolvimento, plasticidade e função de diferentes centros visuais 1-4. As conseqüências moleculares, celulares e fisiológicos desta privação sensorial pode fornecer insights sobre como o desenvolvimento normal é regulada e como estabelecido circuitos corticais enfrentar e mudar sua estrutura e função em resposta a uma extensa tal alteração na experiência.
Existem diferentes métodos de privação visual e todos eles têm suas vantagens específicas em pesquisas relacionadas à visão. Por exemplo criação escuro especificamente elimina impulsionado visualmente atividade, no entanto, não afeta a atividade da retina espontâneo. Da mesma forma, suturas tampa ou tapa-olhos remover modelada vil entrada sem perturbar a atividade espontânea, mas eles permitem a penetração da luz dispersa através dos olhos fechados. Esses métodos são reversíveis e têm mostrado ser úteis para a compreensão do papel de visão e de baixo nível de correlação modelado de entradas binocular em esculpir circuitos corticais durante o desenvolvimento 6-8. Na pesquisa de glaucoma, o modelo de esmagamento do nervo óptico em animais adultos, tem sido amplamente utilizado porque estabelece uma perda progressiva das entradas de células do gânglio retinal que formam o nervo óptico 9,10. Por outro lado, a enucleação, em que o olho e a retina é completamente removido e, instantaneamente, é a escolha apropriada de privação quando o objectivo é o de remover irreversivelmente visão tanto espontânea e modelado de uma só vez. Ela induz também um desequilíbrio actividade intra-ocular robusta que pode melhorar a relação sinal-ruído em estudos de mapeamento de actividade 11,12. Comparando as mudanças funcionais e estruturais em resposta a enucleação com those após a privação por métodos menos drásticas, como sutura tampa por exemplo, também pode expor novos insights sobre o papel da atividade da retina espontâneo em ambos os tipos de homeostase e de plasticidade sináptica.
Enucleação desencadeia uma perda de influências tróficas em alvos diretos da retina. Por exemplo, os níveis de BDNF são significativamente downregulated no núcleo lateral geniculado (LGN) e colículo superior de ratos adultos enucleadas 13. Espécies reativas de oxigênio, que funcionam como moléculas mensageiras para mediar remodelação estrutural, também foram detectados em estruturas subcorticais do rato adulto sistema visual 14. Além disso, microglia e ativação astrocitária através de diferentes estruturas alvo visuais subcorticais no rato ocorrer em um período de tempo pós-enucleação específico de uma semana 15. Juntos, os resultados desaferentação ópticas em diferentes respostas subcorticais no glial, nível estrutural e molecular. Apesar destes subcorticalefeitos, não implica necessariamente efeitos no nível cortical 16. Notável, plasticidade cortical inter-modal, incluindo modificações em outras áreas sensoriais ao lado do fortalecimento de insumos não-visuais para o córtex visual privados ocorrer após tanto monocular (ME) 3,4,17,18 e binocular (BE) 1,17 enucleação.
Para além de contribuir para neuroscience visual, enucleação como um tipo de desaferentação pode ser utilizado para estudar o equilíbrio entre a 19 neuroprotectores e neurodegenerativos 20-22 propriedades do sistema nervoso central.
Diferentes procedimentos para realizar a enucleação já descritos na literatura. Certas metodologias para in vivo ME em ratos e camundongos são menos simples devido ao corte desnecessário de músculos orbitais e tecido 23-25. Outras publicações, tais como Mahajan et al (2011) 5. Fornecer um protocolo detalhado usando dissecção romba para uma coleção de alto rendimento de olhos para estudar as correlações genótipo-fenótipo, provavelmente post-mortem. Para a sua finalidade, o método é rápido e conveniente. No entanto, este método é menos adequado para visualização in vivo, quando se opta enucleação para estudar o caminho visual aferentes a seguir a enucleação (em animais vivos) em vez do próprio olho. Em tal cenário, a sobrevivência pós-enucleação é de grande importância. Além disso, um mínimo de danos vivo e preservação do nervo óptico e do tecido orbital é favorável. Aqui, nós apresentamos um método alternativo enucleação, mais semelhante ao descrito por Faguet et al (2008) 26, que oferece certas propriedades vantajosas:. Está associado com uma recuperação pós-operatória rápida e é caracterizado por um limite muito baixo de aprendizagem para os pesquisadores. Em geral, os métodos são complementares diferentes dependendo do foco de pesquisas subsequentes: morfologia do olho ou de investigação via visual.
ve_content "> Em suma, a enucleação pode ser aplicado a partir de pesquisas de visão para investigações de plasticidade homeostática e cross-modal cérebro, propriedades de resposta da glia, e estabilidade axônio. Neste artigo visualizados, demonstramos um método viável e confiável para in vivo enucleação do olho em o mouse.Para realizar a enucleação de sucesso de acordo com o nosso método, os passos mais críticos a serem considerados são: 1) usando uma pinça com ponta curva e serrilhada de tamanho adequado; 2) realizar a enucleação em uma superfície lisa e seca; e 3) aumentando gradualmente a velocidade até os movimentos circulares no sentido com o mínimo de atrito.
Para um resultado eficaz, é imprescindível a utilização de uma pinça adequada, caracterizada por uma ponta curvada e dentada (tamanho do bico preferido: mouse: 0,5 x 0,4 mm; rato: 2,15 x 1,3 mm). A curvatura permite um fácil acesso ao nervo óptico após o deslocamento do globo ocular e é necessário para a colocação correta das mãos ao executar os movimentos circulares. Dicas lisos não são recomendadas, uma vez que não têm a aderência necessária ao segurar o nervo óptico. A falha em realizar o nervo óptico adequadamente durante os movimentos circulares resulta na ruptura da artéria oftálmica, pobre descolamento do olho e, por conseguinte, uma fraca reprodutibilidade.Por isso recomenda-se a primeira prática desta técnica em animais sacrificados para a otimização da pinça de manipulação para garantir bem-estar animal máximo uma vez a aplicação do método in vivo. Enucleação ocular sucesso tem sido, recentemente, também realizado no rato no nosso laboratório utilizando a mesma técnica, excepto para virar o corpo do animal e manter manualmente a pinça estacionário.
Uma limitação da técnica é que ela poderia danificar a retina. Portanto, este método é menos adequado para a recolha de retinas de realizar histologia 5. Além disso, o nosso método é limitada para deixar a abertura do olho idades desde o olho tem de ser deslocado a partir da tomada, sem remoção ou corte das pálpebras.
Enucleação dos olhos de diferentes espécies, incluindo roedores, é rotineiramente realizado utilizando métodos alternativos, que frequentemente implicam a remoção das pálpebras e o corte do nervo óptico 18,23-25. Estes metods tendem a ser mais invasivos e têm uma curva de aprendizagem mais elevada do que a técnica aqui descrita. Sem a necessidade de remover ou suturando as pálpebras, o tempo de recuperação pós-operatório é minimizado, resultando em maior bem-estar dos animais e os resultados mais reprodutíveis.
The authors have nothing to disclose.
We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.
Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim Vetmedica | N/A | |
Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
Moria MC31 Forceps – Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Narrow Pattern Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products) |