Summary

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Published: October 06, 2014
doi:

Summary

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Abstract

Les cellules myéloïdes sont des cellules immunitaires les plus abondants dans les tumeurs et il a été démontré pour favoriser la progression de la tumeur. Techniques d'imagerie intravitale modernes permettent l'observation du comportement cellulaire vivent à l'intérieur de l'organe, mais peut être difficile dans certains types de cancer dû à l'accessibilité d'organes et de la tumeur tels que l'intestin. L'observation directe des tumeurs de l'intestin n'a pas été rapportée précédemment. Une intervention chirurgicale décrite ici permet l'observation directe de la dynamique des cellules myéloïdes dans les tumeurs intestinales chez des souris vivantes en utilisant des souris transgéniques rapporteurs fluorescent et traceurs injectables ou des anticorps. A cet effet, un quatre couleurs, multi-région, micro-lensed disque filature microscope confocal qui permet l'imagerie continue à long terme avec l'acquisition rapide d'images a été utilisé. Apc Min / + souris qui développent de multiples adénomes de l'intestin grêle sont croisés avec des souris c-fms-EGFP pour visualiser les cellules myéloïdes et des souris ACTB-ECFPà visualiser les cellules épithéliales de l'intestin des cryptes. Les procédures pour le marquage de composantes de tumeurs, tels que les neutrophiles et les vaisseaux sanguins, et la procédure de positionnement de la tumeur pour l'imagerie à travers la surface séreuse sont également décrits. Films time-lapse compilées à partir de plusieurs heures de l'imagerie permettent l'analyse du comportement des cellules myéloïdes in situ dans le microenvironnement intestinal.

Introduction

Des preuves irréfutables démontrent maintenant que le microenvironnement de la tumeur, constitué de populations cellulaires hétérogènes, y compris les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et inflammatoires, la matrice extracellulaire et les facteurs solubles, joue un rôle crucial dans l'initiation et la progression des tumeurs solides, en contribuant à la quasi-totalité caractéristiques du cancer 1. En effet, au cours de la progression de la tumeur, il existe des interactions dynamiques constants entre les cellules cancéreuses et les cellules transformées stromales qui évoluent à générer un micro-environnement favorable à la malignité 2. Parmi les cellules immunitaires infiltrant la micro-environnement de la tumeur, les cellules myéloïdes sont les plus abondants 3. Composé de macrophages associés aux tumeurs (TAM), les cellules suppressives myéloïdes dérivées (MDSC), les cellules dendritiques (DC) et les neutrophiles (PMN), les cellules myéloïdes sont recrutés dans la moelle osseuse et infiltrent progressivement les tumeurs, en libérant des cytokines, des facteurs de croissance et des protéases qui peut favoriserla croissance de la tumeur et la propagation 4. La diaphonie entre les cellules cancéreuses et les cellules myéloïdes est complexe mais dynamique. Ainsi, la compréhension de la nature de leurs interactions est cruciale pour déterminer pourquoi ces cellules favorisent la progression du cancer au lieu de participer à une réponse immunitaire anti-tumorale, et peut aider à trouver de nouvelles cibles pour le contrôler.

L'observation directe par microscopie intravitale fournit des informations sur la dynamique des cellules dans les tissus de souris vivantes 5. A quatre couleurs, multi-région, micro-lensed filature disque système confocal a été conçu pour étudier les cellules stromales dans les tumeurs mammaires 6. Cette approche permet une imagerie continue à long terme et comprend plusieurs avantages tels que (a) l'acquisition des images rapides afin de minimiser les artéfacts de mouvement, (b) l'anesthésie à long terme, (c) quatre d'acquisition de couleur pour suivre différents types de cellules, (d) marquage fluorescent des différentes composantes tumorales, et (e) l'observation de différents micro-environnements tumoraux esprithin la même souris pour éviter la souris à la variabilité de la souris 7-9. Avec cette technologie, les comportements cellulaires différentes ont été rapportées dans le virus de la tumeur mammaire de modèle (MMTV) polyome milieu de promoteur-oncogène T entraînée (PyMT) qui affiche les étapes progressives de la tumorigenèse. Lymphocytes T régulateurs (Treg, visualisées par le transgène Foxp3 EGFP) migrer préférentiellement à proximité des vaisseaux sanguins que DCs (CD11c-DTR-EGFP), des fibroblastes de carcinome associé (FSP1 + / + -EGFP) et des cellules myéloïdes (c-fms -EGFP) présentent une motilité supérieure à la périphérie de la tumeur à l'intérieur de la masse tumorale. Dans la condition d'hypoxie systémique aiguë, les cellules ont migré différemment: Tregs arrêter la migration contrairement aux cellules myéloïdes qui continuent à se déplacer 6. En outre, dans le même modèle de la souris, il a été montré que la sensibilité de la doxorubicine change avec le stade tumoral, la distribution du médicament est lié à la réponse aux médicaments, et de la doxorubicinetraitement conduit au recrutement de CCR2-dépendant des cellules myéloïdes à des tumeurs. Ainsi, l'imagerie en direct peut également être utilisé pour mieux comprendre la réponse aux médicaments in situ et la biologie de la chimiorésistance 10,11.

Polypose adénomateuse familiale (Apc) des mutations génétiques se produisent généralement dans les adénomes colorectaux humains et les carcinomes 12 et mutation d'une seule copie des résultats de gène APC dans la polypose adénomateuse familiale (FAP), qui confère un risque extrêmement élevé de cancer du côlon 13. La souche de souris Apc Min / + porte une mutation de troncature au niveau du codon 850 du gène APC et développe spontanément plusieurs adénomes intestinaux à travers l'intestin grêle, du 14 au 16. Imagerie intravitale à long terme de l'intestin est difficile en raison de l'envahissement de la procédure, depuis l'ouverture de la cavité péritonéale est nécessaire pour accéder à l'intestin. Imagerie en temps réel à court terme studies ont déjà été publiés sur l'intestin sain 17,18, mais l'observation directe à long terme des tumeurs intestinales n'a pas été signalée. Une intervention chirurgicale a été conçu et raffiné pour visualiser des tumeurs à travers la surface séreuse de l'intestin, en utilisant le système de microscopie intravitale disque rotatif utilisé auparavant à l'image des tumeurs mammaires 6,10. Dans cet article, un protocole est décrit qui permet de suivre le comportement des cellules myéloïdes dans les tumeurs dans l'intestin grêle en utilisant Apc Min / + souris.

Protocol

NOTE: Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC), UCSF. Toutes les expériences d'imagerie sont des procédures non-survie et les animaux ont été euthanasiés immédiatement après la fin de l'acquisition de l'image. 1. génération de souris REMARQUE: Apc Min / + souris, porteuses d'une mut…

Representative Results

En utilisant la microscopie confocale disque filage, de tissus non tumoraux et tumorales dans l'intestin grêle de Apc Min / +; ACTB-ECFP; souris c-fms-ECFP peuvent être visualisées à partir de la surface séreuse. Après l'exposition, le logiciel de l'appareil photo est utilisé pour analyser et ajuster l'acquisition (Figure 1 supplémentaire). Après l'administration intraveineuse (iv) l'injection de 2000 kDa fluorescent rhodamine-dextra…

Discussion

Dans cet article, un protocole détaillé est décrit pour la filature disque imagerie confocale de la dynamique des cellules myéloïdes in tumeurs intestinales pendant plusieurs heures dans un animal vivant, imagé du côté de la séreuse de l'intestin.

Pour éviter l'inflammation et d'avoir des conditions physiologiques optimales, l'imagerie de l'intestin qui doit être fait sur l'organe intact. Cependant, l'imagerie de la face séreuse de l'intestin est d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Ying Yu pour Apc Min / + souris génotypage. Cette étude a été soutenue par des fonds de l'INSERM et de subventions (CA057621 et AI053194) des National Institutes of Health.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
ApcMin/+ mice Jackson Laboratory 2020
ACTB-ECFP mice Jackson Laboratory 3773
cfms-EGFP mice Jackson Laboratory 18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated Invitrogen D7139
Isoflurane Butler Animal Health Supply 29450
Nitrogen UCSF
Oxygen UCSF
1X PBS UCSF cell culture facility
Saline Buffer UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 UCSF Monoclonal antibody core Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse
Atropine LARC UCSF Use at 1mg/Kg mouse
Alcohol wipes Becton Dickinson 326895
28G1/2 insulin syringe Becton Dickinson 329465
Remium cover glass Fisher Scientific 12-548-5M 24×50-1
Superfrost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15 25x75x1mm
Krazy glue Office Max 7111555
Betadine LARC UCSF
Heat blanket Gaymar Industries
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn ON 30min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch Electron Microscopy Sciences 72310-10
Anesthesia system Summit Anesthesia Support
Inverted microscope Carl Zeiss Inc Zeiss Axiovert 200M
stage insert Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors Starr Life Sciences MouseOx
Nebulizer Summit Anesthesia Support
Imaris Bitplane
mManager Vale lab, UCSF Open-source software
ICCD camera Stanford Photonics XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head Yokogawa Corporation CSU-10b

References

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Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e51916, doi:10.3791/51916 (2014).

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