Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
La absorción y distribución de los nutrientes y las sustancias tóxicas influyen fuertemente en el crecimiento vegetal. En consecuencia, la investigación de los procesos de transporte subyacentes constituye un área importante de la investigación en biología de las plantas y de las ciencias agrícolas 1,2, especialmente en el contexto de la optimización nutricional y el estrés ambiental (por ejemplo, estrés por salinidad, toxicidad de amonio). El principal de los métodos para la medición de los flujos en las plantas es el uso de trazadores radioisotópicos, que fue desarrollado significativamente en los años 1950 (véase, por ejemplo, 3) y sigue siendo ampliamente utilizado hoy. Otros métodos, como la medición de agotamiento de los nutrientes del medio de la raíz y / o la acumulación en los tejidos, el uso de microelectrodos vibrantes ion-selectivos tales como MIFE (microelectrodos ión estimación de flujo) y SIET (escanear técnica electrodo selectivo de iones), y el uso de colorantes fluorescentes selectivos de iones, también se aplican ampliamente, pero están limitados en su capacidad para detectar la gripe netaxes (es decir, la diferencia entre la afluencia y de flujo de salida). El uso de radioisótopos, por otro lado, permite al investigador la capacidad única de aislar y cuantificar los flujos unidireccionales, que se puede utilizar para resolver los parámetros cinéticos (por ejemplo, K M y V max), y proporcionar una idea de la capacidad, energética, mecanismos y regulación, de los sistemas de transporte. Las mediciones de flujo unidireccionales hechas con radiotrazadores son particularmente útiles en condiciones donde el flujo en la dirección opuesta es alta, y el volumen de piscinas intracelular es rápida 4. Por otra parte, los métodos de radiotrazadores permiten mediciones que se llevan a cabo bajo concentraciones bastante altas de sustrato, a diferencia de muchas otras técnicas (ver "Discusión", más abajo), ya que el isótopo trazado se observa contra un fondo de otro isótopo del mismo elemento.
Aquí, ofrecemos los pasos detallados para la medición radioisotópica de unidireccional y net flujos de nutrientes minerales y las sustancias tóxicas en plantas intactas. Se hará énfasis en la medición de flujo de potasio (K +), un macronutriente planta 5, y amoniaco / amonio (NH 3 / NH 4 +), otro de macronutrientes que es, sin embargo, tóxico cuando está presente en altas concentraciones (por ejemplo, de 1 10 mM) 2. Usaremos los radioisótopos 42 K + (t 1/2 = 12.36 h) y 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respectivamente, en las plántulas intactas de la cebada sistema modelo (Hordeum vulgare L .), en la descripción de los dos protocolos clave: afluencia directa (DI) y el análisis compartimental por flujo de salida de trazador (CATE). Debemos tener en cuenta desde el principio que este artículo sólo se describen los pasos necesarios para llevar a cabo cada protocolo. En su caso, se proporcionan breves explicaciones de los cálculos y la teoría, pero detalladas exposiciones de cada técnica'S fondo y la teoría se pueden encontrar en varios artículos sobre el tema clave 4,6-9. Es importante destacar que estos protocolos son ampliamente transferibles al flujo análisis de otros nutrientes / sustancias tóxicas (por ejemplo, 24 Na +, 22 Na +, Rb + 86, 13 NO 3 -) y para otras especies de plantas, aunque con algunas salvedades (véase más adelante) . También hacemos hincapié en la importancia de que todos los investigadores que trabajan con materiales radiactivos deben trabajar bajo una licencia organizado a través ionizante regulador de la seguridad radiológica de su institución.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se demuestra en los ejemplos anteriores, el método radiotrazador es un poderoso medio de la medición de los flujos unidireccionales de nutrientes y sustancias tóxicas en planta. Figura 1 muestra que NH 3 afluencia puede llegar a más de 225 mmol g -1 h -1, que es tal vez el más alto bona fide transmembrana flujo siempre informó en un sistema planta 13, pero la magnitud de este flujo no sería visible si sólo se midieron los flujos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
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