The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.
Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.
成熟したバルブは特殊な細胞外マトリックス(ECM)バルブ間質 細胞(VICの)が点在し、心臓弁内皮細胞(vecSを1)の単層によってカプセル化された三層状の層から構成されている。 ECMの役割は、心周期中に血行力学的力の一定の変化に耐えるために必要なすべての生体力学的特性を提供することにある。成人弁における弁ECMのターンオーバーは、緊密疾患の非存在下で大幅に静止し、線維芽細胞様であるのVICによって調節される。 VIC集団に加えて、心臓弁内皮細胞(vecSを)は、弁尖2の表面上中断されない内皮を形成する。弁の構造と機能のためのECMおよびVICの重要性は、米国及び他によって説明してきたが、vecSをの役割はあまりよく知られている。しかし、この比較的小さな細胞集団は、胚における弁形成に重要であり、バルブ内の機能不全として記載されている病気。
房室運河と流出管領域内の内皮細胞のサブセットは、(EMT)間葉転換に内皮を受け、心内膜クッション1,3として知られる隆起を形成する。胚における心臓弁の形成が始まるこれらの構造内に、新たに変換された間葉系細胞は、後のVICに分化し、成熟したバルブを形成している。 EMTが完了すると、クッションの周囲の内皮細胞は、vecSをと呼ばれる傷害に対する成熟弁を保護する中断の内皮細胞層を形成する。また、vecSをは血行動態環境を感知し、分子的なECMホメオスタシス1,3を調整するために、基礎となるのVICと通信することが示されている。病気のバルブでは、VEC単層のECM組織内の異常な変化と変更された生体力学4,5に関連して破壊されている。また、マウスモデルにおける研究は、VEC機能不全弁dの根本的な原因であることを示唆しているisease 1,6-9。 vecSをバルブの開発、維持、および疾患において重要な役割を果たしているように、私たちは完全にフィールドを進め、病気のメカニズムを理解するために、それらの時間的表現型を定義することが重要である。
いくつかの研究室による以前の研究は、成功したブタおよびヒツジモデル10-12からvecSを単離しました。によるこれらのバルブのサイズが大きいため、磁気ビーズ細胞分離し、単一細胞クローン性増殖純粋な集団11-13を生成するのに効果的であるなど、異なる分離方法の数、続いて、スワブおよび/ または酵素消化を介して単離。しかしながら、これらのモデルは、高いコストに加えて、分子ツールの利用可能性を制限するブタ及びヒツジゲノムの不完全なアノテーションに限定的であることができる。そのため単離後ブタおよびヒツジvecSをの実験は、制限することができます。マウスモデルは、遺伝子manipulaための多くの可能性に好ましいると胚および成人における分子ツールは、今日まで、小動物モデルにはVECアイソレーションは報告されていない。これは、現在、それによって抗体ベースの単離方法を防ぐ、VEC特異的マーカーの一意の識別情報を欠いている少数の細胞集団を含む小さな組織サンプルでの作業の困難性がある。
本稿では、胚および成体段階でのネズミvecSを直接単離するための新しい方法を報告している。このプロトコルは、すべての内皮細胞型においてGFPを発現し、広範囲の内皮細胞集団14を研究するために使用されているのTie2-GFPマウスを利用する。しかし、この現在の研究の新規性は、初めて、これらのマウスは、バルブから内皮細胞を単離するのに利用されていることである。弁組織及びFACSソーティング続い9の酵素消化の一連の慎重な切開により、vecSを単離することができるとにおけるさまざまな実験手法のために使用直接仕分け以下、RNA抽出と文化をcluding。
ここでは、初めてのTie2-GFPマウスから胚および成体マウスvecSを単離するための新規な方法を説明します。このマウス系統は広範に内皮細胞集団の単離のために使用されているが、これはvecSを選択的に単離を示す最初の報告である。原因VEC人口の脆弱性に、私たちは胚および成体マウスの心臓弁からのGFP陽性(及びGFP陰性)細胞の単一細胞の単離を可能にする厳格なプロトコルを開発した。のTie2-GFPマウス14からの全胚または臓器を使用して、元の出版物と比較して、私たちは、細胞の選択集団を単離するために、この脆弱な内皮細胞集団の低量に基づいて、コラゲナーゼおよび解剖の手順を最適化した。
VECアイソレーションは、以前は限られた遺伝的および生体分子ツールを使用して大規模な動物モデルで報告されている。これらのツールは、よく、したがって、ABIをマウスで確立され、マウスvecSをを単離するのリティは、心臓弁の研究に使用される実験デザインの拡張セットを可能にする。したがって、このアプローチの重要な利点は、vecSを、野生型マウス、および弁疾患および傷害のモデルから時間的に分離することができることである。第二の利点は、vecSをより正確インビボでの状況を反映した発現パターンを維持し、ほぼ直後に切開した後に単離し、分析することができることである。さらに、この分離プロトコルは、数拡張のための細胞培養物を排除するのに十分であり、したがって、 インビトロ環境によって誘発される潜在的な表現型の変化が防止される。
ノベルティとこのプロトコルの実験的な利点にもかかわらず、私たちは制限が依然として存在することを認識している。まず、マウスバルブ内VEC集団のサイズが非常に小さいので、複数の時限胚性同腹仔を、遺伝子発現分析のための十分なRNAを生成するために必要とされる。 THIながらsは複数のブリーダーを使用して克服することができ、それはいくつかのポストの分離解析ツールの適用に影響を与える可能性があります。この制限は、特に分子プロフィールおよび機能アッセイを含む、VECの表現型のより完全な分析を実行するために、GFP陽性vecSをの密集培養を確立するための課題となっている。そこで私たちはすべての困難は私たちのアプローチによって克服されたことを認めますが、これは私たちが克服するために努力している関心のある分野である。
弁膜地域からvecSをを分離するこのアプローチは、心室心筋内の心内膜、または血管構造の提携GFP陽性、非弁膜内皮細胞からの汚染の可能性を紹介します。今日まで、他の心臓の内皮細胞集団からvecSを分子区別が同定されていない。しかしのNFATc1遺伝子のエンハンサー領域を同定し、特にそうでないvecSをラベルを付けることが示されているEMTを受けず、心臓18内には他の内皮細胞集団。 のCreモデル(NFATC1 承諾 ) が利用可能であるため、今後の研究では、汚染リスクを最小限に抑えるために、この行の特異性を利用することができる。非弁膜のTie2-GFP-陽性細胞に加えて、弁尖が中隔や壁画、心筋壁の環状領域にアタッチするポイントで筋細胞からの汚染の可能性が常にあります。ここでは図示していないデータでは、最初に抗GFPおよび抗CD31でコーティングされた抗体結合ビーズを用いて解剖し弁膜地域からvecSをを分離するために研究を始めた。このアプローチは内皮細胞を単離するために成功したが、私たちは、隣接する、非内皮細胞型、したがって、VICの、私たちの実験試料を汚染された心筋細胞から顕著な細胞凝集を経験した。これは、パラメータが、単一細胞懸濁液を分離するために設定されているように、FACS分析を使用して回避された筋細胞特異的遺伝子の発現を検出するためのsおよびPCR分析は、この制限( 図3)を制御している。私たちの汚染が最小限とみなすことができるが、それはGFPおよび内皮細胞特異的表面マーカーの二重選択を将来的に避けることができる潜在的な実験複雑残る。
このプロトコルを用いて、正常胚および成体マウスからvecSを単離し、このアプローチはGFP陽性およびGFP陰性細胞集団のRNAの単離および細胞培養のために使用することができる方法の例を提供している。しかし、このアプローチは、これらの用途に限定されるものではなく、分子、細胞および機能的なアプローチの過多のために使用することができる。また、Tie2の-GFPの背景は、健康および疾患におけるVEC集団の比較研究を可能にする遺伝的マウスモデルと交配することができます。この新規方法論の開発は、最初に、集中的研究を可能にするバルブの開発と保守におけるvecSをの寄与を調べ、内皮依存性の弁疾患の以前に正しく評価されていないメカニズムを解明できた。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、FACS分析と技術支援のためのオハイオ州立大学総合がんセンターの分析サイトメトリーコアファシリティ、特にカトリーナ·ムーアに感謝。さらに、私達は彼らの科学的な洞察のために博士ウィリアムPu及び彼のグループを認識しています。この作品は、NIH HL091878(JL)と全国小児病院ハートセンターによってサポートされていました。
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Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
EDTA, 0.5M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
Medium 199 1X | Corning Cell gro | 10-060-CV | |
Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning Cell gro | 21-040-CV | |
PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 | |
Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
Tissue forceps #5 11cm | Dumont | 14096 | |
Trizol | Ambion | 15596018 | |
α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |