This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
في النباتات والطحالب الخضراء، وضوء استولت عليها المجمعات حصاد الضوء (LHCs)، وهي عائلة من بروتينات الغشاء لا يتجزأ التي تنسق الكلوروفيل والكاروتينات. في الجسم الحي، يتم طي هذه البروتينات مع المواد الملونة لتشكيل المجمعات التي يتم إدراجها في الغشاء الثايلاكويد للبلاستيدات الخضراء. التشابه عالية في الخصائص الكيميائية والفيزيائية للأعضاء الأسرة، جنبا إلى جنب مع حقيقة أنها يمكن أن يخسر بسهولة أصباغ خلال العزلة، ويجعل تنقية في حالة الأم صعبة. وقد وضعت نهجا بديلا للحصول على الاستعدادات متجانسة من LHCs بواسطة Plumley وشميت في عام 1987 1، الذي أظهر أنه من الممكن لإعادة بناء هذه المجمعات في المختبر بدءا من أصباغ المنقى وapoproteins تكشفت، مما أدى إلى المجمعات مع خصائص مشابهة جدا لتلك التي من مواليد المجمعات. هذا فتح الطريق لاستخدام البكتيرية البروتينات المؤتلف وأعرب عن في المختبر </eم> إعادة. طريقة إعادة قوية لأسباب مختلفة: (1) الاستعدادات نقية من المجمعات الفردية يمكن الحصول عليها، (2) تكوين الصباغ يمكن السيطرة عليها لتقييم مساهمتها في البنية والوظيفة، (3) ويمكن تحور البروتينات المؤتلف لدراسة وظيفية دور مخلفات الفردية (مثل صبغة ملزمة المواقع) أو مجال البروتين (مثل التفاعل البروتين البروتين، قابلة للطي). وقد تم تحسين هذه الطريقة في العديد من المختبرات وتطبيقها على معظم المجمعات حصاد الضوء. بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة إعادة تشكيل المجمعات ضوء حصاد في المختبر المستخدمة حاليا في المختبر لدينا، ويتم توفير أمثلة تصف تطبيقات الأسلوب.
جهاز التمثيل الضوئي للنباتات والطحالب تشمل البروتينات التي تربط الغشاء لا يتجزأ من الكلوروفيل (شيلي) أ، ب (شيلي ب) والكاروتينات (سيارة). هذه المجمعات الصباغ البروتين تنشط في مجال الطاقة ضوء الحصاد ونقل أن طاقة الإثارة إلى مراكز رد فعل، حيث يتم استخدامه للترويج تهمة الفصل 2. وهم يشاركون أيضا في آليات التغذية المرتدة التنظيمية التي تحمي الجهاز من التلف الضوئي ضوء ارتفاع 3،4. تتكون المجمعات حصاد الضوء (LHCs) من عائلة كبيرة من البروتينات ذات الصلة في النباتات والطحالب 5.
تنقية متجانسة من كل عضو من أعضاء الأسرة وقد تعقدت من الخصائص الكيميائية والفيزيائية مشابهة إلى حد كبير من المجمعات. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تؤدي الإجراءات تنقية في فقدان أصباغ أو العوامل المساعدة الأخرى المحتملة مثل الدهون. في المختبر تمثيلا إعادةTS وسيلة قوية للتغلب على هذه المشاكل. وأعيد تشكيل LHC المرتبطة الضوئي الثاني (LHC-II) لأول مرة في المختبر بواسطة Plumley وشميت في عام 1987 1. استخراج الباحثون delipidated البروتين وأصباغ بشكل منفصل من البلاستيدات الخضراء النباتية، ومن ثم الجمع بين الحرارة التشويه والتحريف بروتين مع أصباغ في وجود ليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS)، تليها ثلاث دورات التجميد والذوبان 1. وأظهر الباحثون أن الخصائص الطيفية للمجمعات المصادم أعيد كانت مشابهة جدا لمجمعات تنقيته من النباتات. سهولة إعادة تشكيل المصادم المجمعات الصباغ البروتين، من المحتمل بسبب بعض المتأصلة ميزة التجميع الذاتي، جنبا إلى جنب مع صعوبة في عزل المجمعات المنقى من الكائنات الحية، أدى إلى اعتماد سريع للطريقة قبل باحثين آخرين. وقد تحقق إعادة تشكيل البروتينات الضوئي overexpressed في القولونية (E. كولاي) عن طريق بولسن وزملاؤه في عام 1990 6. في E.وعادة ما ترد القولونية والبروتينات الغشاء overexpressed في الهيئات إدراج، الذي مرافق تنقية بهم. ويتحقق من خلال إعادة تمسخ الحرارة الهيئات إدراج تحتوي على البروتين المؤتلف في وجود LDS، تليها إضافة أصباغ الذي يبدأ البروتين للطي. للطي من مجمع LHCII هي عملية من خطوتين: أولا، لا بد من الكلوروفيل في أقل من 1 دقيقة. ثانيا، لا بد الكلوروفيل ب واستقرت على مدى عدة دقائق 7.
بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة على ديناميات قابلة للطي، في إعادة المختبر جنبا إلى جنب مع الطفرات الموجهة الموقع قد يسمح بتحديد الأحماض الأمينية محددة هامة للاستقرار (على سبيل المثال، 8،9) أو التنسيق الصباغ (على سبيل المثال، 10). وقد حددت التلاعب refolding الظروف من خلال تعديل معايير مثل تكوين الصباغ أو المنظفات أيضا عناصر criticaلتر للطي السليم، مثل شرط من Xanthophylls للمجمع LHCII (على سبيل المثال، 1،11). وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحقيق في خصائص أصباغ الفردية منضمة إلى المجمعات الممكن استخدام المجمعات تشكيلها في الجسم الحي (على سبيل المثال، 10).
الطريقة الموصوفة هنا يبدأ عزل الصبغات (الكلوروفيل والكاروتين) من السبانخ والطحالب الخضراء كلاميدوموناس reinhardtii. التعبير وتنقية البروتين LHC من E. القولونية في شكل هيئات إدراج بعد ذلك بالتفصيل، تليها إعادة تشكيل LHC وتنقية اللاحقة ني عمود النسب. في الخطوة النهائية، وتنقيته المجمعات أعيد مزيد من السكروز التدرج الطرد المركزي لإزالة أصباغ حرة وتكشفت صميم بروتيني. يمثل هذا البروتوكول إجراء الأمثل دمج العديد من التعديلات التي أدخلت من قبل مختبرات مختلفة خلالالوقت 1،6،10،12 -14.
بروتينات غشاء ليست سهلة حتى للدراسة. عزل بروتينات غشاء الأم معقد بسبب الحاجة إلى ذوبان طبقة ثنائية الدهون مع المنظفات، التي يمكن أن تتلف البروتينات وإزالة العوامل المساعدة الأساسية. قد تكون هذه البروتينات موجودة أيضا عند مستويات منخفضة في الأغشية البيولوجية، أو تكون مختلطة مع البروتينات ترتبط ارتباطا وثيقا، كما في حالة المجمعات الحصاد الخفيفة، التي تجعل تنقية المجمعات واحدة صعبة. مغاير التعبير البروتين في E. القولونية وإعادة المختبر توفر إمكانية تجنب هذه المشاكل. في المختبر وإعادة تنقية النتائج البروتينات مطوية في المجمعات التي تمتلك خصائص مشابهة جدا لتلك المجمعات الأم 20،21،23، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة المجمعات التي لا يمكن تنقيته لالتجانس 24 – 27.
يستخدم هذا الأسلوب السبانخ، وهو بسهولة attainabلو مدار السنة، كمصدر لمجموع كاروتينويد الصباغ والاستعدادات. لبعض reconstitutions البروتينات الأم إلى الطحالب، ويفضل استخدام أصباغ تنقيته من الطحالب بسبب التراكيب الصباغ مختلفة. وشيلي أ / ب نسبة ونسبة شيلي / سيارة لا يزال هو نفسه بغض النظر عن مصدر الصباغ.
من المهم أن ندرك أن كفاءة إعادة عادة حوالي 35 28٪. وبالتالي فمن الضروري إزالة أصباغ غير منضمة وصميم بروتيني تكشفت من الحل بعد إعادة. ويرد بروتوكول تنقية من خطوتين في هذا البروتوكول (انظر النتائج أيضا). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الخطوة التدرج السكروز لا يسمح الفصل التام بين الاشتقاق وهولو البروتين. بالنسبة لمعظم التحليلات هذه ليست مشكلة، لأن صميم بروتيني لا يحتوي على أصباغ وبالتالي لا تتداخل مع القياسات الوظيفية. ومع ذلك، في حال كان من الضروري إزالة تماما صميم بروتيني من الابعمل تتضمن مجمع تشكيلها (على سبيل المثال، لحساب الصباغ إلى البروتين رياضيات الكيمياء)، يمكن استخدام عمود الصرف أنيوني (انظر Passarini وآخرون 2009 29 للحصول على التفاصيل).
القدرة على refold البروتينات المؤتلف حصاد الضوء مع أصباغ معزولة في المختبر يوفر فرصة ل"التلاعب" المجمعات عن طريق تعديل إعادة تشكيل "البيئة" بطرق مختلفة، وبالتالي تغيير خصائص معقدة الناتجة عن ذلك. على سبيل المثال، تغيير تشكيل الصباغ خلال إعادة يمكن أن يؤدي في مجمع مع تكوين الصباغ غيرت. ويمكن استخدام هذه الميزة لدراسة تأثير مختلف الصبغات لها على بنية واستقرار المجمع. عادة إعداد الصباغ الحصول عليها من السبانخ يحتوي على نسبة شيلي أ / ب من 3: 1 ونسبة / سيارة شيلي من 2.9: 1. هذا ينتج عادة نسبة البروتين أعيد مع نفس الخصائص كما نسالبة واحدة. ومع ذلك، يمكن تعديل نسبة شيلي أ / ب بإضافة تنقية شيلي A أو B تؤثر ربط أصباغ مختلفة بسبب الانتقائية من مواقع الربط متفاوتة 30 – 33. وهذا ممكن لأن معظم المواقع الصباغ ملزم لا انتقائية تماما لشيلي في شيلي أو ب، ولكن يمكن أن تستوعب كلا، على الرغم من تقارب مع مختلف 10،30،34. بطريقة مماثلة، وعرضت مواقع الربط كاروتينويد أيضا أن تكون قادرة على استيعاب أكثر من الأنواع كزانتوفيل 8،35 – 38. وترد reconstitutions مختلف من CP26، مجمع الصباغ البروتين أخرى من النباتات العليا، وذلك باستخدام مختلف التراكيب الصباغ في الجدول 2 39. واستخدمت هذه reconstitutions لتقييم تقارب من مواقع معينة أصباغ 39 ملزمة. ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه من أجل الحصول على مجمع بنفس الصباغ جomposition باعتبارها واحدة الأصلي، يجب أن تكون نسبة داا / ب من مزيج الصباغ 3: 1. يبدو أن هذا هو الحال بالنسبة لجميع المجمعات المصادم من النباتات العليا 20،40.
مزيج من البيولوجيا الجزيئية مع تقنية إعادة يسمح خصائص مجمع شيلي ملزم لدراستها بمزيد من التفصيل. أهمية البروتين المجالات المختلفة على استقرار وقابلة للطي من المجمعات، أو مشاركتهم في البروتين البروتين التفاعلات، وقد تم تحديد من قبل اقتطاع صميم بروتيني أو أداء الطفرات العشوائية 8،41 – 44. بقايا حمض أميني واحد مهمة لتنسيق أصباغ مختلفة يمكن تغييرها من خلال الطفرات الموجهة الموقع من أجل تحليل خصائص أصباغ الفردية أو تقييم مساهمتها في وظيفة واستقرار معقدة 10،28،29،45 – 52. الشكل 6 يبين إعادة تكوين Lhcb4 (CP29) معطفرة من الحامض الاميني في موقف 216 53. مقارنة بين تكوين الصباغ من wildtype والمجمعات متحولة تبين أن طفرة يستحث فقدان شيلي جزيء واحد، مشيرا إلى أن الموقع المستهدف يستوعب لشيلي في مجمع WT. الاختلافات من أطياف امتصاص WT ومتحولة، على تطبيع إلى المحتوى الصباغ، ويظهر أيضا خصائص امتصاص الصبغة المفقودة. في هذه الحالة، يمكن رؤية الفرق في ذروة الرئيسية في 680 نانومتر، مشيرا إلى أن شيلي منسقة من قبل His216 يمتص في هذا الطول الموجي (لمزيد من التفاصيل حول هذا المسخ والخصائص الطيفية MOZZO يرى آخرون 2008 53). كما يمكن استخدام تحليل طفرة لتحديد تأثير البيئة على الخواص الطيفية للأصباغ 54.
في الختام، حصاد البروتينات الخفيفة يمكن بسهولة إعادة تشكيل في المختبر مما أدى الصباغ-البروتيناتن المجمعات مع خصائص مشابهة جدا لالمجمعات الأصلية. في هذه الطريقة، يتم استبعاد صعوبات عزل البروتينات الأم، بينما كان يلقى أيضا إعداد البروتين مع ارتفاع العائد والنقاء لمزيد من الدراسة. وأكد داا نسبة 1 أ / ب في إنتاج مجمع أصيلة، وقدمت أمثلة من wildtype تشكيلها وLHCs متحولة لتوضيح تطبيقات هذه التقنية: أهمية وجود 3.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |