Summary

High-throughput Assay per Fenotipo<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Published: August 11, 2014
doi:

Summary

Un test high-throughput per fenotipo Salmonella in vitro o di altra associazione batterica, l'invasione, e la replica in fagociti con capacità high-throughput è stato sviluppato. Il metodo è stato impiegato per valutare Salmonella gene knockout ceppi mutanti per il loro coinvolgimento in interazioni ospite-patogeno.

Abstract

Le specie Salmonella sono agenti patogeni zoonotici e principali cause di malattie di origine alimentare negli esseri umani e bestiame 1. La comprensione dei meccanismi alla base delle interazioni Salmonella -host sono importanti per chiarire la patogenesi molecolare di infezione da Salmonella. Il dosaggio di protezione gentamicina a fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica in fagociti è stato adattato per consentire lo screening high-throughput per definire i ruoli dei mutanti di delezione di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium nelle interazioni host utilizzando RAW 264.7 macrofagi murini. Nell'ambito di questo protocollo, la varianza nelle misurazioni è significativamente ridotto rispetto al protocollo standard, perché wild-type e più ceppi mutanti possono essere testati nello stesso piatto di cultura e, allo stesso tempo. L'uso di pipette multicanale aumenta la produttività e migliora la precisione. Inoltre, le preoccupazioni relative a usare meno host cellule per pozzetto in 96-ben piatto cultura sono stati affrontati. Qui, il protocollo della vitro Salmonella invasione test modificati utilizzando fagociti è stato impiegato con successo per fenotipo 38 singoli mutanti di delezione Salmonella per l'associazione, l'invasione e la replica intracellulare. I fenotipi in vitro sono presentati, alcuni dei quali sono stati successivamente confermato di avere in fenotipi vivo in un modello animale. Pertanto, la modifica, test standardizzato per fenotipo Salmonella associazione, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput potrebbe essere utilizzato più ampiamente per studiare le interazioni batteri-ospite.

Introduction

Salmonella non tifoidi sono importanti cause di malattie enteriche in tutti i vertebrati. Salmonellosi nell'uomo è tra le prime malattie di origine alimentare batterica 1. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni di Salmonella con i loro host di origine animale è ottenuta principalmente attraverso lo studio di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (STM) in colture di tessuti e modelli animali di infezione. Guadagnando intuizioni nelle interazioni STM-ospite ci aiuterà a capire come Salmonella sopravvivere e crescere all'interno di cellule ospiti. La prima sfida nello studio di queste interazioni è quello di identificare il maggior numero possibile di fattori che partecipano sia da ospite e patogeno, ma questi sforzi sono in gran parte ostacolato dalle notevoli difficoltà di trattare con due sistemi biologici complessi indipendenti simultaneamente, vale a dire, di accoglienza e di Salmonella, in condizioni fisiologiche. Inoltre, la grande repertoOire di Salmonella e geni ospitanti potenzialmente codificanti fattori coinvolti in interazioni ospite necessitano di high-throughput piattaforma biologico per affrontare questa sfida.

Un modificato, test standardizzato per fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput è stato sviluppato per esaminare un ampio set di geni probabilmente impegnati in interazioni Salmonella -host. Il saggio di protezione gentamicina è stato sviluppato nel 1973 2, ma è stato accuratamente descritto da Elsinghorst nel 1994 3,4. Ora è diventato uno strumento standard per lo studio di molti batteri patogeni intracellulari ex vivo, tra cui Salmonella 5,6. Batteri internalizzati evitare di essere ucciso da alcuni antibiotici, come la gentamicina, che non possono penetrare le cellule eucariotiche 3. Sfruttando questo fenomeno, il saggio protezione Gentamicina misura la sopravvivenza e la crescita di ba intracellularepatogeni cterial. Tre eventi durante l'infezione, cioè, l'associazione con le cellule eucarioti, l'invasione e la replica, possono essere valutati per batteri patogeni intracellulari in base l'intervallo di tempo tra l'infezione, il trattamento Gentamicina, e in seguito di incubazione (Figura 1). Linee di cellule eucariotiche forniscono un ambiente fisiologico che è meno complessa di modelli animali per studi di interazione ospite-patogeno.

Il test di protezione gentamicina è una piattaforma appropriata per studiare le interazioni STM-ospite, ma il test standard in un piatto di coltura 24 pozzetti num bassa velocità. Analisi computazionale dei set di dati in vivo identificato 149 prodotti genici Salmonella che si prevede di interagire con circa 300 prodotti genici ospite (dati non pubblicati). Il test di protezione gentamicina standard non ha la capacità di fenotipo questo numero di mutanti in modo efficiente.

In Additione, il saggio di protezione Gentamicina può teoricamente rilevare l'invasione di anche un singolo batterio. A causa di questa sensibilità intrinseca, i dati grezzi sono suscettibili di variazioni tecniche quando ripetuto in tempi diversi. I controlli interni e la presentazione dei dati relativi dopo la normalizzazione sono essenziali per l'interpretazione significativa dei risultati. Alla luce di queste considerazioni, una versione modificata, standardizzato test di protezione gentamicina è stato sviluppato per migliorare la capacità di test e aumentare la precisione.

Il protocollo seguito è dettagliata e illustrata per eseguire il test di protezione Gentamicina modificato utilizzando 96 pozzetti piatti della cultura e la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 murino. Rispetto al protocollo standard a 24 pozzetti piastre di coltura, il protocollo modificato presenta i seguenti vantaggi: 1) Uso di 96 pozzetti piatti della cultura permette fino a 10 diversi ceppi mutanti per essere phenotyped compresi i controlli interni positivi e negativi con potenza statistica sufficiente;2) La varianza dei risultati è notevolmente ridotta, in quanto i ceppi mutanti vengono testate nello stesso piatto cultura e allo stesso tempo; 3) L'uso di pipette multicanale aumenta il throughput riducendo la fatica dell'operatore. Infine, il confronto a 24 pozzetti piastre di coltura, le preoccupazioni di meno cellule ospiti per pozzetto a 96-ben piatto cultura sono state affrontate attraverso l'ottimizzazione e la standardizzazione del protocollo.

In sintesi, la modifica, test standardizzato per vitro fenotipo Salmonella o altra associazione batterica, l'invasione e la replica in fagociti aumenta la precisione e raggiunge la capacità high-throughput riducendo la fatica dell'operatore.

Protocol

1 murino macrofagi RAW264.7 Colture Cellulari Crescere basso numero passaggio macrofagi murini, RAW264.7 (Il numero ATCC ®, TIB-71) in una coltura cellulare pallone ventilato cap T-75 filtro Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 0,5% NaHCO 3 e 1% 100x non essenziali aminoacidi (NEAA) a 37 ° C, in un incubatore CO 2 5%. Una volta che le cellule raggiungono una confluenza del 60-80% nel pallone, utilizzare un rasch…

Representative Results

Vedere i risultati rappresentativi (Figura 2) dopo che i dati sono tracciate in base alla fagocitosi test invasione delle cellule modificate. I dati comprendono cinque diversi ceppi, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A e B. mutante Δ Inva, noto per essere difettoso per l'invasione, e ΔphoP noti per essere difettoso per la replica 8, sono utilizzati come controlli positivi per valutare la validità sperimentale . Infatti, nel saggio di invasione modificato, un mutant…

Discussion

Il test di protezione gentamicina è ampiamente usato per studiare l'invasione e la replica di batteri patogeni intracellulari all'interno della cellula ospite, ed è soprattutto un importante strumento biologico per lo studio di agenti patogeni, come la Salmonella, la cui invasione è il passo presupposto indispensabile per l'infezione 1. La protezione dosaggio standard di gentamicina nella comunità di ricerca di Salmonella è implementato in 24-ben piatto cultura 5.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per i National Institutes of Health NIAID (per AJB e LGA, R01 AI076246). La collezione mutante di Salmonella è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni (per MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 e R01 AI075093-01), in parte dal National Institutes of Health sovvenzioni (per HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Ringraziamo Steffen Prowollik per la placcatura replica e confermando i mutanti della collezione.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11965
Fetal bovine serum HyClone SH30910.03
T-75 cell culture flask vented filter cap Nest Biotechnology 708003
100X Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140
Cell scraper BD Falcon 353086
96-well cell culture plate Corning Incorporated 3595
Luria-Bertani (LB) broth MP Biomedicals 3002-075
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube BD Falcon 352059
PBS pH7.4 (1x) Life Technologies 10010
Triton X-100 Sigma T-8787
Kanamycin solution Sigma K0254
Gentamicin solution Sigma G1272
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200
Trypan blue Sigma T8154

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Cite This Article
Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C., Andrews-Polymenis, H., McClelland, M., Bäumler, A. J., Adams, L. G. High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages. J. Vis. Exp. (90), e51759, doi:10.3791/51759 (2014).

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