Vari modelli murini di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) sono ampiamente utilizzati nella ricerca sul cervello sperimentale. Qui, dimostriamo il modello di transcranica permanente distale MCAO che produce coerente infarto corticale di misura corrispondente al danno imposto dalla maggioranza degli ictus ischemici umani.
L'ictus è la terza causa più comune di morte e una delle cause principali di disabilità adulta acquisita nei paesi sviluppati. Sono disponibili per una piccola percentuale di pazienti con ictus in fase acuta opzioni terapeutiche molto limitato. La ricerca attuale è intensamente alla ricerca di nuove strategie terapeutiche ed è sempre più concentrando sulla fase sub-acuta e cronica dopo il colpo perché più pazienti potrebbero beneficiare di interventi terapeutici in una finestra di tempo prolungato. Questi meccanismi ritardato includono importanti vie fisiopatologiche come post-ictus infiammazione, l'angiogenesi, la plasticità neuronale e la rigenerazione. Per analizzare questi meccanismi e valutare in seguito nuovi bersagli farmacologici, modelli di ictus sperimentali con rilevanza clinica, bassa mortalità e alta riproducibilità sono ricercati. Inoltre, i topi sono i mammiferi più piccoli in cui un tratto lesione focale può essere indotta e per i quali un ampio spettro di modelli transgenicidisponibili. Pertanto, si descrive qui il modello murino di transcranica, coagulazione permanente dell'arteria cerebrale media tramite elettrocoagulazione distale delle arterie lenticulostriatal, il cosiddetto "modello coagulazione". L'infarto conseguente questo modello si trova principalmente nella corteccia; il volume dell'infarto relativo rispetto alla dimensione del cervello corrisponde alla maggioranza dei tratti umani. Inoltre, il modello soddisfa i criteri sopra menzionati di riproducibilità e bassa mortalità. In questo video dimostriamo i metodi chirurgici di induzione ictus nel "modello di coagulazione" e riportiamo strumenti di analisi istologiche e funzionali.
L'ictus è la terza causa più comune di morte e uno dei principali motivi di disabilità adulta acquisita nei paesi sviluppati 1. Circa il 80% di questa malattia neurologica acuta è causata da ischemia cerebrale risultante da una ostruzione del flusso sanguigno cerebrale mentre circa il 15% è causato da una emorragia intracerebrale 2. Nonostante le ricerche in corso, la somministrazione endovenosa di attivatore tissutale del plasminogeno è il solo trattamento farmacologico approvato per l'ictus ischemico finora e disponibile solo per una minoranza di pazienti con ictus a causa della finestra temporale breve approvato 4.5 ore dopo l'insorgenza dell'ictus 3,4. Poiché non vi sono modelli in vitro, che può modellare adeguatamente le complesse interazioni tra il cervello, sistema vascolare e meccanismi fisiopatologici sistemici durante la corsa, i modelli animali sono essenziali per la ricerca preclinica ictus.
Pertanto, diversi modelli ictus ischemico sono stati sviluppati in una variabileety di specie. Uno dei modelli corsa più comunemente usato è il "modello filamento" in cui un filamento sutura viene transitoriamente introdotto nell'arteria carotide interna e trasmesso finché la punta occlude l'origine cerebrale media (MCA), con conseguente arresto del flusso sanguigno e il successivo infarto cerebrale di sottocorticali e in caso di occlusione prolungata anche regioni corticali 5,6. Nei modelli photothrombotic di ictus ischemico, una occlusione fotochimica del vaso corticale irradiato viene raggiunto dopo l'iniezione di un fotosensibilizzatore conseguente piccole lesioni circoscritte localmente 7. L'occlusione permanente della MCA distale delle arterie lenticulostriatal può essere ottenuto mediante una legatura dell'arteria, la sua compressione transitoria o permanente della coagulazione 8,9. L'infarto conseguente questo modello colpisce prevalentemente neocorteccia 10 perché l'occlusione della MCA in questo modello è distale al lenticoarterie ulostriatal, che forniscono i gangli della base.
Poiché la maggior parte delle lesioni tempi umani si trovano nel territorio dell'arteria cerebrale media, tutti i modelli comuni corsa assomigliano occlusioni di MCA o di uno dei suoi rami 11. Il MCA è una delle principali arterie che fornisce apporto di sangue al cervello; nasce dalla carotide interna, percorsi lungo il solco laterale dove poi rami e progetti alle gangli basali e le superfici laterali del frontale, parietale e lobi temporali, col motore primario e corteccia sensoriale. La destra e la sinistra MCA sono collegati alle arterie cerebrali anteriori e comunicante posteriore arterie che collegano le arterie cerebrali posteriori, creando il circolo di Willis (Figura 1).
Come precedentemente riportato da Carmichael et al. 11, infarti modellate dal distale Medio cerebrale Arteria Occlusion (MCAO) modello in topi comprendono circa il 10-15% dell'emisfero, simulando così una maggioranza di lesioni tempi umani che si trovano nel territorio corticale MCA 11,12. Nel 1981, Tamura et al. Ha descritto un, transcranica modello permanente della coagulazione MCAO nei ratti 8. Tuttavia, il modello descritto da Tamura ha coinvolto un occlusione prossimale del MCA al fine di eludere la biforcazione più distale dell'arteria. Pertanto, il "modello Tamura" originale non solo induce lesioni corticali ma anche striatali, simili alle lesioni ottenuti dal "modello filamento" 6. Qui, descriviamo distale modello MCAO permanente elettrocoagulazione transcranica nei topi. Inoltre, riportiamo istologici correlati e metodi funzionali per analizzare l'esito della corsa in questo modello. Tutti i metodi sono basati su procedure operative standard sviluppate e utilizzate nei nostri laboratori.
Il presente protocollo descrive il modello sperimentale colpo di distale, permanente MCAO da elettrocoagulazione transcranica – il cosiddetto "modello della coagulazione". Questo modello è nel frattempo diventato uno dei modelli animali usati più frequentemente nella ricerca sperimentale ictus 12. Rispetto ad altri modelli di ischemia cerebrale focale, il modello di coagulazione come presentato in questo video ha il vantaggio di un tempo di funzionamento molto breve di circa 10 minuti, quando eseguita da uno scienziato addestrato. Quindi, brevi tempi di anestesia possono essere raggiunti in questo modello, che è una caratteristica favorevole di un modello sperimentale di ictus perché l'impatto degli anestetici sul risultato neuroprotezione e ictus è ben noto 15. Inoltre, come precedentemente descritto da Carmichael et al. 11, ci confermano che il risultante volume dell'infarto e localizzazione dopo distale permanente MCA coagulazione corrisponde a lesioni cerebrali ischemiche nella maggioranza dei umanacolpi in proporzione alle dimensioni del cervello. Ictus umano è principalmente di piccole dimensioni con lesioni di circa il 5-15% della semisfera, sulla base di studi di popolazione e precedenti studi di imaging clinico 16-18, in contrasto con lesioni estese tempi con edema cerebrale compressione che si verificano in meno del 10% dei colpi clinica 19. In tal modo, lesioni ictus nel territorio MCA di circa il 12% dell'emisfero raggiunto dal modello presentato può essere considerato come un volume di ictus traduzionalmente rilevante. Tuttavia, si deve tener conto del fatto che diversi ceppi di topi o protocolli di anestesia utilizzati potrebbero influenzare il conseguente volume della lesione 20.
La mortalità durante il periodo di osservazione dopo induzione colpo in questo modello è praticamente assente. La mortalità totale inferiore al 5% è costituito principalmente da morti durante il funzionamento a causa di complicazioni anestesiologiche o sacrificio perché raggiungere dei criteri di esclusione. Al fine di garantire la bassa variability di questo modello e la sua eccellente riproducibilità, suggeriamo i seguenti criteri di esclusione: 1) Qualsiasi emorragia subaracnoidea durante l'operazione. 2) Tempo di funzionamento più di 15 min. 3) La ricanalizzazione della MCA dopo due tentativi di elettrocoagulazione con solo transitoria MCAO. Inoltre, gli animali devono essere esaminati al giorno dopo MCAO (comportamento fisiologico di base, l'aspetto della pelliccia e del peso corporeo) per il controllo del dolore, il disagio o il comportamento di malattia.
Diverse misure potrebbero essere attuate per l'analisi dei risultati della corsa come misura macchiolina laser, risonanza magnetica, test comportamentali o analisi istologica. In questo protocollo forniamo metodi esemplari per l'analisi del comportamento e analisi del volume dell'infarto. Diversi test analisi comportamentale dopo ischemia cerebrale focale sono stati sviluppati e utilizzati nella ricerca sperimentale ictus. Prove idonee per sensomotoria disfunzione precedentemente utilizzato dal nostro gruppo in questo modello stroke 21,22 siamore il test Rotarod 23, prova di etichetta Sticky 24, prova Angolo 25 e il test cilindro 13, che è dimostrato in questo video. Il test cilindro rappresenta costantemente asimmetria motore nella fase acuta dopo distale MCAO permanente e rileva anche ritrovare consecutivo della funzione motoria.
Nonostante gli evidenti vantaggi, alcuni limiti di questo modello corsa devono essere presi in considerazione. In primo luogo, una trapanazione del cranio è necessaria al fine di coagulare l'arteria, producendo in tal modo un potenziale accesso per peri-operative infezioni del cervello, sebbene infezioni batteriche della ferita chirurgica, muscolo temporale o il cervello stesso non sono mai stati rilevati da noi o documentata da altri che utilizzano questo modello. Inoltre, danni meccanici alla corteccia durante la preparazione e la coagulazione non può essere escluso, ma può essere limitato da un'attenta perforazione e rimozione del cranio, costante umidificazione del sito chirurgico e ne minima elettrocoagulazione sario (vedi criteri di esclusione). Anche se il corso della MCA come illustrato nella Figura 2 si trova nella maggior parte dei topi C57BL / 6, si descrive nel protocollo come procedere nei normali variazioni del corso nave per minimizzare modello variabilità. Inoltre, si consiglia l'uso di più (3 in caso di biforcazione; 2 senza biforcazione dei MCA) siti di occlusione per ridurre al minimo il rischio di ricanalizzazione parziale del MCA, che nella nostra esperienza è un fattore importante per la variabilità di questo modello.
In termini di test comportamentali, solo i deficit comportamentali minori possono essere rilevati nei test comportamentali sopra citate e la rigenerazione funzionale, possono essere osservati entro la prima settimana dopo l'ictus. Quindi, i sistemi di prova più avanzate con maggiore sensibilità e parametri di test qualitativi come il test raggiungendo esperto 27 potrebbero essere più adatto da rilevare risultato funzionale a lungo termine in questo modello.
ONTENUTO "> Infine, a causa della coagulazione permanente della MCA nessuna riperfusione può essere ottenuta, che è una caratteristica osservata in una percentuale significativa di pazienti con ictus causa spontanea lisi del coagulo o terapia 28. Tuttavia, un modello precedentemente descritto ictus tromboembolico 26 fornisce l'opzione per un modello ictus omaggio con riperfusione di ischemia cerebrale corticale. Presi insieme, l'alta riproducibilità, l'eventuale osservazione a lungo termine a causa della mortalità minimo e il comparabile volume relativo di infarto e localizzazione rispetto al tratto umano distinguere il "modello di coagulazione" come un modello importante per la ricerca di base e traslazionale ictus.The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal cluster di eccellenza della Fondazione di ricerca tedesca "Munich Cluster per sistemi Neurologia (Synergy)" e dalla Fondazione Daimler-Benz AL
Camera Canon Eos 500D | Canon | optics: 18-55 mm; 30 fps; 640×480 video function | |
Mirror | Kristallform | 2677089 | 30×30 cm |
Transparent acrylic glass cylinder | H&S Kunststofftechnik | diameter: 8 cm, height: 25 cm | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Bepanthen pomade | Bayer | ||
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Electrosurgical device | ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät | ||
Drill | Proxxon | D-34343 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Xylacine | Albrecht | ||
5ml Syringe | Braun | ||
Phosphate Buffered Saline PH: 7,4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 |