An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Les virus enveloppés utilisent des glycoprotéines membranaires sur leur surface d'entrée de médiation dans des cellules hôtes. Analyse la structure tridimensionnelle de ces glycoprotéine 'pointes' est souvent techniquement difficile, mais important pour la compréhension de la pathogenèse virale et dans la conception de médicaments. Ici, un protocole est présenté pour virale détermination de la structure de pointe par le biais de la moyenne de calcul de données cryo-tomographie électronique. Cryo-tomographie est une technique en microscopie électronique utilisée pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles tomographiques de volume, ou des tomographies, des échantillons biologiques tels que les virus polymorphes de la membrane dans un état quasi-native, congelé-hydraté. Ces tomographies révèlent des structures d'intérêt en trois dimensions, mais à faible résolution. Moyenne de calcul de sous-volumes, ou sous-tomographies, est nécessaire pour obtenir plus de détails de la résolution de la répétition des motifs structuraux, tels que pointes de glycoprotéines virales. Une approche de calcul détaillé pour aligning et moyenne sous-tomographies à l'aide du logiciel Jsubtomo est décrite. Cette approche permet la visualisation de la structure de pointes de glycoprotéines virales à une résolution de l'ordre de 20-40 Å et l'étude de l'étude de la hausse des commandes pic-à-pic interactions sur la membrane du virion. Les résultats typiques sont présentés pour le virus Bunyamwera, un virus enveloppé de la famille des Bunyaviridae. Cette famille est un groupe structurellement divers agents pathogènes constituent une menace pour la santé humaine et animale.
Electron cryo-tomographie est une technique d'imagerie cryo-microscopie électronique permettant le calcul d'un à trois dimensions (3D) de reconstruction des échantillons biologiques complexes. Spécimens appropriés vont de complexes macromoléculaires purifiés 1, 2 filaments, vésicules enrobées 3, et les virus polymorphes de la membrane 4 à 5 cellules procaryotes entiers et même des zones minces de cellules eucaryotes entiers 6. Après la collecte de données d'une inclinaison de la série, les volumes tomographiques 3D, ou des tomographies, peut être calculée en utilisant plusieurs logiciels, y compris celles bSoft 7 et 8 MID.
Deux aspects inhérents à l'étude d'échantillons biologiques par la limite d'électrons cryo-tomographie l'interprétation biologique des volumes tomographiques correspondant. Tout d'abord, en raison de la limitation de la dose d'électrons qui peut être appliquée à des matières biologiques avant d'introduire dégâts d'irradiation importante, signaratios l-bruit dans les données tomographiques sont généralement très faibles. Deuxièmement, à la suite d'un échantillonnage limité géométrie d'inclinaison lors de la collecte de données, des vues de l'objet restent absents, conduisant à une soi-disant «manque de coin 'artefact dans le volume tomographique. Cependant, ces deux limitations peuvent être surmontées si le volume tomographique contient répéter des structures identiques, tels que des complexes macromoléculaires, qui peuvent être avec succès moyennes 9-12.
Avant moyenne des structures de reconstructions de tomographie, les objets d'intérêt doivent être trouvés et alignés à la même orientation. La localisation de ces structures peut être réalisée par corrélation croisée d'une structure de matrice dans le volume tomographique utilisant une approche souvent dénommé modèle correspondant 13. Le modèle utilisé dans ce processus d'adaptation peut être dérivé de cryo-microscopie électronique ou électronique de cryo-tomographie par reconstruction 3D combiné, ou il peut être une carte de densité de simulationune structure atomique. Plusieurs forfaits de calcul ont été développés pour mener à bien ces tâches 11.
Calcul de la moyenne des pics de la glycoprotéine du virus de la membrane, comme le VIH-1, a été une approche particulièrement efficace pour l'étude de la structure 14 à 16. Une bonne compréhension de la structure fait partie intégrante de révéler à la fois les bases moléculaires des interactions virus-hôte et l'orientation du développement de la conception antiviral et un vaccin. Bien que la cristallographie macromoléculaire est la technique de choix pour la haute résolution (généralement mieux que 4 Å) Analyse structurale des glycoprotéines virales et de leurs complexes, les structures de rayons X résultant de cette méthode sont des protéines isolées de l'environnement membranaire naturel sur le virion . Ainsi, les détails importants tels que l'architecture d'ordre supérieur de glycoprotéines virales, dans le contexte du virion, demeurent insuffisantes. D'autre part, cryo-microscopie électronique et reconstruction de particule uniquedes virus enveloppés ensemble est limité à virions à symétrie icosaédrique 17,18. Cryotomography électronique associée à l'alignement de sous-volume est donc apparue comme une technique complémentaire qui permet l'étude des pics de la glycoprotéine de forme irrégulière, les virus polymorphes in situ.
Nous avons développé un logiciel nommé Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) pour la détection, l'alignement et la moyenne des sous-volumes tomographiques. Jsubtomo a été utilisée dans la détermination de la structure d'un certain nombre de structures cellulaires et virales 19-26. Ici, nous présentons un protocole détaillé, qui permet de déterminer les structures de pic viral de la surface. Pour contourner excès de raffinement structures moyennes en corrélant le bruit, le schéma de raffinement «étalon-or» est adoptée 10,27. Enfin, les stratégies pour la visualisation et l'interprétation des résultats typiques sont discutés.
Connaissance de la structure virale de pointes de glycoprotéines de la membrane du virion est essentielle pour comprendre la réplication du virus et le développement de thérapies pour traiter et prévenir l'infection. Cryo-microscopie électronique combinée avec une moyenne de particule est apparue comme la méthode la plus utilisée pour résoudre les structures de particules virales enveloppées, y compris les pointes de glycoprotéines. Cependant, cette méthode est limitée aux virus icosahedrally symétriques. Ici, grâce à l'application de cryo-tomographie et subtomogram moyenne dans Jsubtomo, nous avons défini un protocole général pour la détermination de pointes de glycoprotéines sur pléomorphique virus enveloppés qui ne se prêtent pas à d'autres méthodes structurelles en cours de biologie. Nos résultats représentatifs montrent que la résolution de cette méthode est suffisante pour révéler un aperçu de l'architecture de domaine, oligomérisation, et plus l'organisation de l'ordre de pointes de glycoprotéines sur des virions intacts.
jove_content "> L'étape la plus critique dans le protocole construit deux modèles de départ fiables qui sont statistiquement indépendantes l'une de l'autre. exécution réussie de cette étape suppose que les pointes de glycoprotéine sont suffisamment importants et non emballés contre l'autre trop serré, de sorte que les pics individuels peuvent visuellement reconnus et repris manuellement dans le tomographies, et deux modèles indépendants moyenne. Si cela n'est pas possible, deux modifications du protocole peuvent être tentées. Tout d'abord, deux modèles aléatoires indépendantes peuvent être construits en définissant d'abord deux sous-ensembles aléatoires de subtomograms puis la moyenne des subtomograms 30 à l'intérieur de ces sous-ensembles. D'autre part, si la structure de la pointe isolée a été extraite par d'autres moyens, par exemple par cristallographie aux rayons X, il peut être utilisé en tant que modèle de départ. Cependant, il faut veiller à faible ou filtre passe-bas ce modèle en utilisant un seuil de faible résolution (50-70 Å), que les deux modèles qui en résultent dans la prochaine ronde de raffinement serastatistiquement indépendantes qu'au-delà de cette résolution. En raison de cette mise en garde, la première approche est recommandée.La résolution obtenue à partir de ce protocole dépend de quatre facteurs principaux: i. stratégie de collecte de données et de la qualité des données d'entrée, ii. nombre des subtomograms, iii. la précision de l'alignement des subtomograms, et iv. hétérogénéité des structures. Alors que la première et deuxième limitation peut être en grande partie résolu par l'aide de détecteurs de haute signal-bruit directs électroniques combinés avec la FCE corrigé la tomographie et la collecte de données automatisée, la précision de l'alignement est en outre affectée par la taille et la forme de la structure d'intérêt lui-même. Lors de l'application de ce protocole sur les petites pointes qui n'ont pas traits saillants, il peut être avantageux de lier des fragments Fab à la pointe pour améliorer la précision d'alignement et donc la résolution 31. Enfin, si les structures de calcul de la moyenne présentent des conformations multiples, sous-tomogrh méthodes de classification peuvent être utilisés pour différentes conformations moyenne séparément. À cette fin, Jsubtomo s'intègre avec le paquet Dynamo, offrant classification de subtomogram puissant 9.
Le protocole ci-dessus est complémentaire de la cristallographie aux rayons X des glycoprotéines virales isolées. Structures cristallographiques peuvent être montés dans des moyennes de sous-tomogramme d'obtenir l'orientation précise de la glycoprotéine par rapport à la membrane du virion. L'application de cette méthode sera sans aucun doute continuer à faire la lumière sur la structure du virus enveloppés et physiopathologie.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |