Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.
אחת השאלות החשובות באקולוגיה של חיידקים הוא "מי נמצא שם?" שאלה זו ניתן לענות באמצעות כלים שונים, אבל אחד מסטנדרטי זהב לטווח הארוך הוא רצף amplicons 16S RNA ריבוזומלי גן (rRNA) שנוצרה על ידי ברמת תחום PCR תגובות הגברה מהדנ"א הגנומי. באופן מסורתי, זה בוצע על ידי שיבוט וסנגרתי (אלקטרופורזה נימים) רצף של amplicons PCR. כניסתו של רצף של הדור הבא פישטה מאוד והגדילה את עומק הרצף לסידור של גני 16S rRNA. כניסתה של מרצפים המעבדתיים עכשיו מאפשרת מעבדות קטנות לבצע רצף rRNA 16S שלהם בבית בעניין של ימים. כאן, גישה לרצף amplicon גן 16S rRNA באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא מפורטת. DNA הסביבתי מוגבר לראשונה על ידי PCR באמצעות פריימרים המכילים מתאמי רצף וברקודים. אז הם מצמידים את חלקיקים כדוריים באמצעות תחליב PCR. החלקיקים הם loaded על שבב חד פעמי והשבב מותקן במכונת הרצף לאחר שהרצף מתבצע. רצפי תאוחזרנה בפורמט fastq, מסונן וברקודים משמשים להקמת חברות במדגם של הקורא. מסונן וזרק לפח כניסות לאחר מכן ניתח נוסף תוך שימוש בכלים זמינים בפומבי. ניתוח דוגמא שבה קורא סווגו עם אלגוריתם מציאת-טקסונומיה בתוך חבילת תוכנת Mothur הוא נתון. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה, זולה ופשוט, וצריכה לעזור למעבדות קטנות יותר כדי לנצל מהמהפכה הגנומי המתמשכת.
רצף metagenomic הוא טכנולוגיה מאוד חזקה כפי שהוא מתמקד בשלמותו של המידע הגנטי הכלול במדגם סביבתי. יש טעמים שונים של רצף metagenomic, כוללים רצף רובה ציד, ספריות גדולות להוסיף ורצף amplicon. רצף Amplicon מציע את היתרון של להיות זול יחסית, מהיר ומסוגלים לייצר קורא מאזור הגנומי יחיד שיכול להיות מתואם בדרך כלל. בנוסף, זרימת העבודה ניתוח נתונים עבור סידור amplicon בעיקר טופל. עם זאת, מאחר שהוא מבוסס על PCR, יש לו את כל ההטיות הקשורים לייחוד שלם, כיסוי חלקי ופריימר מטה את 1,2, מה שהופך את הגישה זו חצי כמותית, במקרה הטוב. מספר אזורים הגנומי יכולים להיות ממוקדים עבור סידור amplicon כוללים גנים פונקציונליים, אבל האפשרויות הפופולריות ביותר הן להשתמש בגני סמן כגון גן 16S rRNA כדי ליצור פרופיל קהילה. באופן מסורתי, seque amplicon גן 16S rRNAncing בוצע תוך שימוש בטכניקות עבודה אינטנסיביות שכללו שיבוט בE. coli, קטיף מושבה והפקת פלסמיד ואחריו סנגר רצף על פלסמידים המבודדים, וכתוצאה מכך, רוב המחקרים ניתחו לדגימה פחות מ -100 שיבוטים. רצף של הדור הבא הביא שתי התקדמות גדולה: במקביל מסיבית של תגובות ברצף, והכי חשוב, הפרדה משובט של תבניות ללא הצורך להכניס שברי גנים במארח. זה פישט מאוד את הרצף של amplicons גן 16S rRNA, שנמצא עכשיו בחזרה כתכונה שגרתית של לימודי מיקרוביולוגיה הסביבתית רבים, וכתוצאה מכך "רנסנס" עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 3.
מאז כניסתו של רצף רוש 454 ב2005 4, מספר טכנולוגיות רצף של הדור הבא אחרות הופיעו בשוק (למשל, Illumina, מוצק, PacBio). לאחרונה, את ההקדמה של רצף ספסל העליוןrs הובא למעבדות קטנות קיבולת הרצף פעם אחת בלעדית למרכזי רצף גדולים. חמש מכונות benchtop זמינות כעת: GS Junior 454, אישי הגנום מכונת יון Torrent (PGM) ופרוטון, ומיסק Illumina וNextSeq 500. בעוד שכל מרצפים אלה מציעים פחות קוראים לריצה ופחות בסיסים לדולר ממה שרוב המשרה מלאה מרצפי קנה מידה, הם יותר גמישים, מהירים, ועלויות הרכישה והפעלתם נמוכות הופכים אותם במחיר סביר עבור מעבדות אקדמיות קטנות. מרצפים המעבדתיים במיוחד מתאימים גם לamplicon, הגנום קטן ורצף metagenome נמוכות מורכבות בלימודי מיקרוביולוגיה סביבתיות, כי זה סוג של לימודים בדרך כלל אינו דורש עומק קיצוני של רצף. לדוגמא, אותו יש הסכמה כללית כי לסידור של גני 16S rRNA חוקר את מספר קורא לדגימה הוא לא בעל חשיבות עליונה, כ~ 1,000 קורא יכול ליצור את אותם דפוסים כמרובים מיליון קוראים מערכי נתונים 5. אחרי שאמר את זה, הבא generatio המעבדתיים n sequencers עדיין מייצר כמויות גדולות של נתונים ברצף, עם תשואות מקסימליים של ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (יון Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (יון Torrent פרוטון), ~ 10 Gbp (Illumina מיסק) ו~ 100 Gbp (Illumina הבא Seq 500), וזה יותר ממספיק עבור רוב מחקרי מיקרוביולוגיה הסביבתיים.
רצף של הדור הבא של amplicons 16S rRNA באמצעות מרצפים המעבדתיים הוחל לאחרונה למגוון רחב של סביבות. לדוגמא, יון Torrent PGM היה בשימוש כבר קהילת ניתוחים של שבבים מכרה אורניום שהיו גבוה במיוחד pH ונמוכים חדירות 6, הסירקולציה מחודשת מערכות חקלאות ימית 7, של קרקעות הארקטי מזוהם פחמימנים 8,9, של משקעים מושפעים כריית חולות נפט ו biofilms מנהר Athabasca 10,11, של rhizosphere של עצי ערבה ניטעו בקרקעות מזוהמות 12, של גופות אדם ובעלי חי 13-16 ושל מעכלים אנאירוביים 17.
jove_content "> בפירוט אנו תרומה זו הגישה שלנו לרצף amplicons גן 16S rRNA בתוך הבית באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא (יון Torrent PGM). לאחר מיצוי DNA, גני 16S rRNA הם מוגברים באמצעות פריימרים חיידקים ברמת תחום המכילים מתאמי רצף ורצפים ייחודיים, מדגם ספציפי (ברקודים). amplicons הם מטוהרים, לכמת ונקוו ביחס equimolar. אז הדגימות נקוו הם מוגברות clonally בתחליב PCR ורצף. רצפי כתוצאה מכך הם ניתחו באמצעות כלים ביואינפורמטיקה זמינים לציבור ( למשל, Mothur).השיטה המוצגת כאן היא פשוטה ולא יקרה, וצריכה לאפשר מעבדות רבות כדי לגשת לכוחו של רצף metagenomic. למרות שזה משתנה בהתאם לפלטפורמת הרצף בשימוש, פעם אחת הספריות בנויות על ידיים מעט מאוד זמן נדרש, עם רוב של התהליך automatized. עבור פלטפורמת הרצף משמשת כאן (יון Torrent PGM), ההליך המלא ניתן לבצע בתוך שני ימי העבודה. ברגע הכתיבה (ספטמבר 2013), עלויות מגיב הקשורים לדוגמא המפורטת לעיל היו כדלקמן: הגברה של 36 דגימות PCR: $ 25, quantitation טיהור ג'ל וPicoGreen DNA של 36 דגימות: $ 125, תחליב PCR למדגם amplicon נקווה אחד : $ 150 וריאגנטים רצף: $ 250, עבור הסכום כולל של 550 $ או 15 $ למדגם או 0.0015 $ לקריאה מסונן באיכות. מחיר זה אינו כולל מכשיר חוזה שירות, פחת מכשיר, שכר טכנאי ושימוש בשטח מעבדה.
אוהל "> אחד הצעדים החשובים ביותר הוא לאגם את כל המוצרים ביחס equimolar, כדי לאחזר מספר דומה של קורא לכל אחת מהדגימות. כימות PicoGreen שימש כאן, אלא בשיטות אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי פחות מדויק (למשל, כימות UV, כימות מבוסס ג'ל). גם על ידי עושה כימות ואיגום מדויקים ביותר, יש כמה השתנות במספר קורא לדגימה, ובטווח האופייני המפורטים בטבלה 2, זה נע בין 4,380 ל 32,750 קורא, עם ממוצע של 10,338 קורא. אם עיבוד מספר גדול של דגימות (יותר מ 40-50), ניתן להחליף טיהור ג'ל עמודה אחת על ידי טיהור ג'ל בחרוזי צלחת או טיהור באמצעות עם הפסקת גודל מחמיר (למשל, חרוזים AMPure) .נכון להיום, טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא ביותר בשימוש לגן 16S rRNA היא 454. טכנולוגיית ריצוף יון Torrent שימוש בפרוטוקול זה באופן רעיוני דומה מאודל454 ושני הטכנולוגיות נוטות לאותו הסוג של טעויות רצף. באופן לא מפתיע, זה היה הראה כי רצף יון Torrent הביא תוצאות רצף דומות מאוד ל454 רצף 10. לאחרונה, חוקרים רבים בחנו את השימוש בטכנולוגית Illumina עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 18,19. בכל מקרה, זה יהיה קל להתאים את הפרוטוקול הנוכחי למרצפים המעבדתיים אחרים כמו מיסק Illumina או 454 GS Junior על ידי שינוי רצפי פריימר ההיתוך כדי להתאים את המתאמים ורקודים דרושים לטכנולוגיות רצף אלה, כמו בשיטה שתואר לאחרונה לIllumina מיסק 19. לחלופין, חוקרים יכולים בצע את השלבים 1 ו -2 של הפרוטוקול המפורט כאן ולשלוח amplicons נקוותה למרכז רצף שבו התחליב PCR וסדר היה להתבצע.
גן 16S rRNA כניסות היו גזוז ומסווג באמצעות Mothur, אבל יכולים להתבצע על הרבה ניתוחים אחריםamplicons גן 16S rRNA. לדוגמא, גיוון בטא יכול להיות מוערך על ידי חישוב מרחקי Unifrac בין כל זוג מדגם באמצעות ההליך המתואר בhttp://unifrac.colorado.edu/ 20. מדדי גיוון אלפא ומספר יחידות מיון שונים מבצעיות של כל דגימה יכולים להיות מחושבים באמצעות כלים בתוך QIIME כמו AmpliconNoise 21 או באמצעות ההליך המתואר על ידי Huse et al. 22 וזמינים בתוך Mothur.
פריימרים משמשים כאן מוגברים האזורים משתנים 3 ו -4 מגן 16S rRNA, אבל יכולים להיות ממוקדים אזורים רבים אחרים. במחקר נוכחי, גני 16S rRNA היו מוגברים מחומר צמחי והבחירה של פריימר נעשתה כדי למנוע הגברה של הכלורופלסט 16S rRNA גן 23,24. יש מגוון רחב של צבעי יסוד זמינים אחרים המשתנים בטווח של אורך המוצר, כוח הטקסונומי ו25,26 תועלת. עם זאת, בכל המקרים 200-400 נ"ב קורא של גן 16S rRNA לא יכול להיות מסווג באופן אמין, ברמת המין, וניתוחים מוגבלים לסוג ורמות מיון השונים גבוהות יותר. גנים אחרים יכולים להיות מתאימים יותר אם יש צורך במידע ברמת מינים, כמו גני cpn60 וrpoB 27,28. טיפות דרסטית בעתיד בעלות של רצף ועלייה בכוחם של כלים אנליטיים עשויות לעשות את זה אפשרי להחליף לסידור של גני 16S rRNA על ידי metagenomics רובה, אבל עד אז סידור של גני 16S rRNA נשאר סטנדרטי למיקרוביולוגיה הסביבתית זהב.
The authors have nothing to disclose.
Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.
Reagent | Company | Catalog Number |
Ion 314 Chip Kit v2 | Life Technologies | 4482261 |
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 | Life Technologies | 4482006 |
Ion PGM Template OT2 200 Kit | Life Technologies | 4480974 |
HotStarTaq Plus Master Mix Kit | Qiagen | 203646 |
Primers and probes | IDT | NA |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
BSA 20 mg/ml | Roche | 10,711,454,001 |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65001 |