Summary

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出

Published: August 01, 2014
doi:

Summary

主要組織適合性複合体クラスII dextramersとの直接染色により脳及び心臓における自己反応性CD4 T細胞を検出するためのプロトコルは、このレポートに記載されている。総合的な分析のために、 その場での抗原特異的CD4 + T細胞の頻度を列挙するための信頼できる方法も考案されている。

Abstract

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.

Introduction

抗原特異的CD4 T細胞の検出のための主要組織適合性複合体(MHC)クラスII四量体を使用することは挑戦であった1-7。 MHCクラスII四量体の検出感度を高めるために、研究チームは、次世代のテトラマー、指定された「dextramers「8を作成した。 Dextramersは、複数のストレプトアビジン-フルオロフォア部分は、いくつかのペプチドテザー、ビオチン化MHCモノマー一つデキストラン分子9に取り付けることができるようにコンジュゲートしたデキストラン骨格を含有する。このように、いくつかのMHC-ペプチド複合体が含まれているのMHC dextramersの大きな集合体は、複数のT細胞受容体(TCR)と対話することができます。

このグループは、最近、様々な自己抗原に対するdextramersを生成し、dextramersの検出感度は、約8四量よりも5倍であることを示した。実験システムは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAを含むE)、プロテオリピドタンパク質(PLP)SJLマウスにおける139-151で誘導し; C57BL / 6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)35-55を用いて誘導EAE;心臓ミオシン重鎖α(MyHCの)A / Jマウスにおける334から352で誘導し、実験的自己免疫性心筋炎(EAM)。この研究は、PLP 139-151の使用を示す- 、それによってフルオロフォア抗体を用いからの信号を増幅する必要がなくなり、直接染色プロトコルを開発することにより、特異性を有するその場で抗原特異的CD4 T細胞を検出するためのMyHCの334から352 dextramers、アプローチは、一般的に四量体の使用に採用。また、組織を包括的に評価する方法はまた、確実にその場 10 における抗原特異的CD4 T細胞の頻度を列挙するために考案されている。 その場での抗原特異的T細胞の検出は、バイスタンダー活性化によって引き起こされるものから、特定の抗原刺激によって引き起こされる事象の描写を可能にする。同様に、 その場での技術はまた、提供します:標的器官における抗原特異的T細胞の浸潤の動態を追跡する機会エス。

Protocol

倫理声明: 全ての動物手順は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに沿って行われ、ネブラスカ大学リンカーン、リンカーン、ネブラスカ大学によって承認された。 EAEの1。誘導 工程1.1:EAEを誘導するために、以下の改変を伴う11に記載のようにペプチド/完全フロイントアジュバント(CFA)エマルジ ​​ョンを調製す?…

Representative Results

本報告書では、MHCクラスII dextramersとの直接染色による抗原特異的、自己反応性CD4 T細胞のin situ検出に記述されている。新たに切断した脳のセクションでは、EAEマウス由来し、PLP 139-151(特定)またはTMEV 70から86(コントロール)dextramersおよび抗CD4を含むカクテルで染色した。 図1のトップパネルは、二重陽性細胞が出現し、黄色のPLP 139-151 dextramers(赤)とCD4抗体(緑)で?…

Discussion

MHCクラスIテトラマーとは違って、日常的なアプリケーションのためのMHCクラスII四量体の使用は、特にそれらの活性化の依存関係6,15-17に一部起因低親和性自己反応性CD4 T細胞の前駆体頻度を列挙するために、挑戦的であり続けている。最近では、この問題は、PLP 139-151、MOG 35〜55およびMyHCの334などの自己抗原の数の抗原特異的CD4 T細胞を検出するために、私達を許可する」、dextramers?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、アメリカ心臓協会と子供の心筋症財団(SDG2462390204001)、および国立衛生研究所(HL114669)によってサポートされていました。 CMは心筋炎財団、ニュージャージー州によって授与ポスドク研究フェローシップ助成金の受取人である。

Materials

CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4οC
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4οC
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4οC
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4οC
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 οC
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4οC
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4οC
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
Dextran conjugated SA-APC  Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4οC
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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