Данио взрослых почки является отличной системой для почечных регенерации и болезненных исследований. Важным аспектом таких исследований является оценка структуры нефрона и функции. Этот протокол описывает несколько методик, которые могут быть реализованы для оценки нефрона канальцев состав и оценить почечную реабсорбцию.
Данио модель стала соответствующей системы для изучения развития почек, регенерации и болезни. Оба эмбриональные и взрослые данио почки состоят из функциональных блоков, известных как нефронов, которые высоко консервативных с других позвоночных, включая млекопитающих. Исследования на рыбках данио недавно показали, что два отличительных явления происходить после взрослых нефроны понести ущерб: во-первых, существует прочная регенерации в рамках существующих нефронов, что заменяет разрушенные канальцев эпителиальные клетки; Второй, совершенно новые нефроны изготавливаются из почечных клеток-предшественников в процессе, известном как neonephrogenesis. В отличие от этого, человека и других млекопитающих, похоже, только ограниченную способность к регенерации эпителия нефрона. На сегодняшний день, механизмы, ответственные за эти явления регенерации почки остаются плохо изучены. Поскольку взрослые данио почки пройти как нефроне регенерацию эпителия и neonephrogenesis, они обеспечивают выдающуюся экспериментальный пунктДигм изучать эти события. Кроме того, существует широкий спектр генетических и фармакологических средств, доступных в данио модели, которые могут быть использованы, чтобы очертить клеточные и молекулярные механизмы, которые регулируют почечной регенерации. Один из важнейших аспектов такого исследования является оценка структуры нефрона и функции. Этот протокол описывает набор методов маркировки, которые могут быть использованы для оценки почечной состав и функциональность тест нефроне в взрослых данио почки. Таким образом, эти методы широко применяются для будущего фенотипической характеристики взрослых данио парадигм повреждение почек, которые включают, но не ограничиваются ими, nephrotoxicant режимов воздействия или генетических методов направленного гибели клеток, таких как нитроредуктаза опосредованной клеточной техники абляции. Кроме того, эти методы могут быть использованы для изучения генетических возмущения в формировании почек взрослого, а также может применяться для оценки почечной статус при моделировании хронической болезни.
Почек представляет собой сложный орган, который выполняет множество физиологических функций в организме. Всего функция почек является метаболический выведение отходов, и эта задача тесно переплетается с поддержании гомеостаза жидкости. Почки выполняет эти работы по фильтрации крови и формирование мочи, в то время как одновременно регулируя кровяное давление, уровень электролитов и кислотно-щелочной баланс. Высоко специализированные эпителиальные трубочки называемые нефроны служить в качестве основного функционального блока почки 1,2. У взрослых позвоночных, нефроны обычно организуются в плотно обмотанный договоренности окружающей централизованную систему дренажа, что позволяет многие трубочки упаковать в довольно небольшом органе. Например, каждый из почки человека могут содержать более 1 миллиона нефронов 3. Другие млекопитающие, как мыши обладают порядка 8-10 тысяч нефронов в почке 4. Степень сложности почечной отличается от этих млекопитающих и других вертebrates, вызванная колебаниями общего количества нефронов и их архитектурного макета в почках. Видов позвоночных образуют целых три последовательные структуры почек во время разработки, и каждая форма проявления Усложнение в отношении нефрона пожертвований и организации: предпочки, мезонефроса и metanephros. Последнее почечная структура будет сохранена служит взрослого почки орган-обычно мезонефроса или metanephros 2. Каждая форма почки, однако, имеет состав нефрона основе 2.
Нефрона является рабочей лошадкой почки и отвечает за фильтрацию крови наряду с секрецией метаболита и трудоустройство. Нефронов простые трубчатые структуры, состоящие из эпителиальных клеток и имеют сегментный организацию, в которой дискретные, узкоспециализированные домены дифференцированных эпителия выполнять конкретные задачи. В порядке фильтрата потока через нефрона, там, как правило, из трех основных частей, что в состае каждая единица: (1) почечное тельце, (2) трубочка с проксимальных, средних и дистальных сегментов, и (3) сбор канал 1. Проксимальных канальцах отвечает за реабсорбции органических растворов, в первую очередь глюкоза и аминокислоты 1. Промежуточный трубочка (или петля Генле) является основным местом соли и воды регулирования 1. Наконец, тонкая настройка соли и других ионов происходит в дистальных канальцах и собирательных канальцев и строго регламентируется эндокринной системы 1. Оттуда, фильтрат проходит через мочеточник и мочевой пузырь, в конечном счете, выхода из тела, как отходы 1.
Потеря функции почек могут быть следствием множества причин, которые мешают нормальной нефроне деятельность. Эти причины могут возникнуть в ходе развития почек, например, врожденные дефекты, приводящие к пороков нефронов 5 или причин от различных видов травм (вызванным как генетическая и environmental происхождение). Приобретенные травмы широком смысле классифицируется как острого повреждения почек (AKI) или хронической травмы почек (ХБП). AKI включает резкую потерю функции почек, часто в результате ишемии или токсина воздействия 6,7. У млекопитающих, нефрон эпителиальных ремонт возможен после таких травм 8, и многие люди проявляют полное восстановление функции почек после AKI. Однако AKI также связано с высокой заболеваемостью и смертностью, который наблюдался в широком 30 – 70% диапазона падения 6,7. CKD, напротив, связан с прогрессирующей потерей функции почек, что является результатом лет длительного повреждения, как правило, связанного с фиброзом 8,9. Кроме того, взаимодействие существует между AKI и CKD, либо как можно предрасполагают индивидуума к другому 10-12. Например, те, кто пострадал от AKI более восприимчивы к CKD и даже смерти 13. Заболеваемость болезнью почек, как в США, и во всем мире, достигла epideмикрофонные пропорции и, по прогнозам, возрастет, как в возрасте населения расширяет-таким образом, существует растущая потребность в определении регенеративные вмешательства медицины для почек 14,15.
Несмотря на знания, что пациенты AKI может восстановиться, она уже давно думал, что почка является органом без врожденных регенеративных полномочий. Этот традиционный вид был значительно пересмотрен в последние годы 16. Исследования следственные повреждение почек у мышей и крыс после AKI показали, что нефрона канальцев эпителиальные клетки могут размножаться и восстанавливать функциональные нефронов 17-20. Хотя млекопитающие обладают этим адаптивную способность к регенерации нефронов, имеются заметные ограничения и неадекватные ответные меры могут быть вызваны, которые приводят к фиброза почек и ХПН 21. Например, недавнее исследование показало, что повторяется эпителиальных абляция сотовый в мышиных нефронов было связано с уменьшением регенерации и фиброза почек-предполагая нефронов ВГАеа ограничивается регенерации порог 22. Там нет никаких доказательств, что взрослый почек млекопитающих формирует новые нефронов заменить потерянные или поврежденные, тем самым их разрушение приводит к постоянному дефицита нефрона 8,9. Интересно, что некоторые позвоночные реагируют на AKI путем регенерации нефронов эпителий и также производство новых нефронов, процесс называют neonephrogenesis или нефрона регенерации 23. Neonephrogenesis происходит в рыбе после воздействия токсина или частичной резекции, и модели травмы исторически включали золотую рыбку 24,25, тилапия 26, кататься на коньках 27 оризия 28, и в последнее время, данио 29,30. Из них, данио обеспечить жизнеспособную генетическая модель исследования, чтобы обнаружить клеточные и молекулярные пути, ответственные за почечной регенерации.
В этом видео статье мы продемонстрируем, как маркировать сегменты нефрона во взрослой рыбок данио. Знание нефрона анатомии, молекулярных особенностей,и функциональные характеристики имеют важное значение для успешных будущих почечных исследований с использованием данио. Взрослый данио почек является структурой мезонефрос и по своей сути менее сложной с точки зрения количества нефронов и организации, чем структуры metanephros найденного у взрослых млекопитающих, птицы и рептилии 31. Тем не менее, данио организация сегмент нефрона аналогично млекопитающих, и была впервые зарегистрирована в почки эмбриона на основе экспрессии генов исследований 31-35. Данио рерио нефроны эмбрион содержит прямолинейных отрезков канальцев, которые включают проксимальных извитых канальцев (РСТ), проксимального прямо канальцев (PST), дистального рано (DE), и дистальной поздно (DL) 31-35 (рисунок 1). Данио рерио взрослых нефроны обладают сходными трубчатые сегменты 30,31,36,37 (Рисунок 1). РСТ также могут быть идентифицированы с помощью функционального фенотипа: эпителиальные клетки в РСТ будет включать флуоресцентно меченные соединения (декстран 10-70 кДа по размеру), присутствующих вциркуляции, который был использован как в эмбриональных и взрослых данио почки, чтобы оценить эндоцитотических поглощение на этих клетках проксимальных канальцев 38-41 (рисунок 1). Одно из различий в сегментах нефрона между данио и млекопитающих является то, что данио не хватает промежуточное трубочку, или петлю Генле 30-37; так как этот сегмент функции у млекопитающих для экономии воды, и данио приведены пресноводные виды без актуальности сконцентрироваться свою мочу, это не удивительно, что данио не хватает этого сегмента 32,33. Таким образом, общий состав нефрона в значительной степени сохраняется между данио и почек млекопитающих 32,33. Эти сходства позволили данио, чтобы быть эффективным инструментом исследования для расследования функций генов почечных выразил во время нефрогенеза развития 32-35,42 и моделировать многочисленные болезни почек 43,44, тем самым добавив к существенному списке человеческих условиях, которые могут быть исследованы с помощьюданио 45,46.
Сегодня, взрослых данио почки привлекательной моделью для сравнительных исследований почечной регенерации благодаря своей генетической сговорчивости и расширяющейся неба технологических ресурсов, имеющихся допросить функции гена и сигнальные пути у этого вида. Несколько исследований использовали данио мезонефрос чтобы исследовать механизмы регенерации после AKI 29,30,37. Для продолжения исследований AKI помощью взрослых данио почку, важно иметь изысканные методы заклеймить различные регионы и методы нефрона обследовать функциональность нефроне. Существует несколько методов для анализа почек взрослого были адаптированы из эмбриональных протоколов почек. Внутрибрюшинное введение флуоресцентную метку декстрана в взрослых данио этикетки эпителий РСТ в мезонефрос нефронов через эндоцитоза 30, как у эмбрионов рыбок данио 38-41 (рисунок 1). Этот метод был использован для visualizэ, когда проксимальных канальцев вернуть их реабсорбции имуществом после ОПН, что позволяет один оценку восстановленной физиологической функции 30 (рисунок 1). Еще одной особенностью в проксимальных канальцах нефрона является то, что эпителиальные клетки в этом сегменте имеют щеточной каемки 37 показывает, что высокие уровни эндогенного активности щелочной фосфатазы. Таким образом, проксимальный эпителий может быть локализован визуально в почке взрослого данио с помощью метода флюоресценции на основе известного как Эльф (меченного ферментом флуоресценция) -97 47.
Здесь мы описываем, как выполнить люминесцентные анализы декстран поглощения 30,48 в почке взрослого данио, так, чтобы получить функциональную оценку проксимальных канальцах и карта размер и контуры этого сегмента канальцев. Далее мы опишем методы, чтобы маркировать проксимальных канальцах регионы взрослого нефрона с флуоресцентной метки щелочной фосфатазы. В-третьих, мы показываем впервые, что Родамина с метками лектин Dolichos biflorus агглютинином (DBA), который был использован в качестве общего маркера из собирательных трубочек в почках млекопитающих 49, отмечает дистальных канальцах взрослого данио почки. Как DBA является взаимоисключающим с щелочной фосфатазы окрашивания, эти ярлыки обеспечивают способ широко отличить пан-проксимально против пан-дистальных участках взрослого данио нефрона. На протяжении реализации этих флуоресцентных красителей в обоих всей горе и криостатных гистологических срезах, мы соотнести эти этикетки с доменов экспрессии генов растворенного вещества транспортеров, которые уникально идентифицируют каждый сегмент нефрона. Поэтому этот протокол также содержит руководство модифицированных процедур обработки тканей для взрослых тканей всей горе в гибридизация анализа (по желанию) на основе проведенного нами эмбриона WISH протокола 50. Эти процедуры могут быть использованы в различных комбинациях (рисунок 2) к документу морфологические и функциональные признаки выводае взрослых нефроны данио почек. Таким образом, эти протоколы могут быть применены к регенерации исследований, фенотипической характеристики других моделей почечной недостаточности, и даже используется для изучения формирование взрослого почки.
Здесь мы описали методы, которые позволяют визуализировать компонентов сегмента нефрона в взрослых данио. Инъекция люминесцентных декстрана конъюгатов позволяет преимущественное маркировку РСТ должное эндоцитотического свойств этих клетках проксимальных канальцев 30,38. Этот метод может быть выполнена с большой гибкостью в связи с существованием декстраны, которые могут быть получены с собранием различных флуоресцентных конъюгатов. Кроме того, использование лизина-декстраны фиксации является особенно удобным способом для обозначения сегментов РСТ, как вторичные процедуры маркировки не требуется. Это позволяет достаточно простой обнаружение сигнала и совместим со многими другими флуоресцентных меток, иммунноокрашивания и использования трансгенных репортеров линий. Щелочная маркировка фосфатазы также отмечает проксимальных канальцах, с сильным реактивности в РСТ и несколько слабее реактивности в PST. Наконец, окрашивание DBA позволяет маркировку дистальных отделах канальцев, которые отображают СНaracteristic разветвленной морфологию. Различные молекулы лектина, которые сахара-связывающие белки из неиммунной происхождения, широко используются, чтобы отличить нефрона млекопитающих сегментов 47. Интересно, что DBA в данио коррелирует с дистальных отделах канальцев, как она используется, чтобы отметить собирательных трубочек в почках млекопитающих 47.
Взятые вместе, эти методы могут быть использованы в различных комбинациях, чтобы документировать почечной состав и функцию. Поскольку все эти методы могут быть использованы в целых препаратов в почках, они обеспечивают инструменты для оценки структуры нефрона и функции на всей территории органа без полностью полагаться на использование более трудоемкий, утомительных методов, например, cryosection работы и иммунноокрашивания. Тем не менее, пятна, описанные в этой статье методы являются жизнеспособными в cryosection. Анализ Cryosection генерирует образцы (по сравнению с целой горе), которые лучше подходят для иммуногистохимии для определения специфических peptiде, хотя, конечно, этот тип анализа требует наличия соответствующих первичных антител. К сожалению, одна из основных ограничений в работе с данио животной модели остается бедным наличие антител. Таким образом WISH остается наиболее широко используется, т.е., "идти к" Процедура анализа экспрессии генов. ЖЕЛАЕМ помощью реакции субстрата BCIP, НБТ, и / или INT производить пурпурный или красный осадок не совместим с флуоресцентной окраски на криосрезов. Одним из вариантов было бы ссылаться на использование флуоресцентной детекции WISH, процедуры, который был оптимизирован для рыбок данио эмбриональных образцов и может быть адаптирована для использования с взрослого почки. Описание методов в этом видео статьи должны позволить для дальнейшего экспериментирования с методами, как флуоресцентного WISH в сочетании с трансгенных данио строк, в которых отдельные сегменты помечены с репортером например, EGFP или mCherry. С другой стороны, способы, описанные здесь, КоулаD испытываться в сочетании с другими жизненно важными красителей, например, других лектинов. Таким образом, дальнейшая адаптация и расширение методов, описанных здесь можно ссылаться в соответствии с потребностями исследователя для целых препаратов и анализа почек монтирования.
Как таковые, эти методы имеют широкий потенциал для реализации с данио модели для текущих исследований регенерации, а также в моделировании генетического заболевания. Существует настоятельная потребность в инновационных исследований и методов лечения почечных недугов. Миллионы людей страдают от той или иной форме заболевания почек каждый год, что является результатом врожденных, острых и / или хронических причин. Кроме того, распространенность заболевания почек продолжает расти во всем мире, что делает эти заболевания глобальная проблема общественного здравоохранения 14,15. Процедуры, такие как гемодиализ доступны посредством внешнего диализа служит избавить кровь пациента метаболического отходов, если их почки не в состоянии выполнить эту роль. К сожалению, Это вмешательство имеет ограничения, как текущее лечение необходимо для выживания. Кроме того, пациенты в конечном итоге потребует пересадки почки, что может занять годы, чтобы получить один раз пациент помещается на листе ожидания. Даже после получения трансплантата почки, многие пациенты страдают неблагоприятных последствий в результате процедуры и должны бороться эти эффекты для остальной части их жизни. Эти трудности продемонстрировать серьезный необходимость разработки новых методов лечения либо помочь предотвратить болезни почек или, возможно, увеличить регенерацию тканей 8,16,52,53. Учитывая очевидные этические ограничения использования испытуемых человека в биомедицинских лабораториях, животные модели имеют важное значение для изучения патогенеза заболеваний человека и для тестирования новых методов лечения. В результате его анатомического сходства и эволюционной близости, мышь стала самой широко используемой моделью человеческого заболевания 45. Тем не менее, есть определенные ограничения с этим животным, ВКЛЮЧАЕТчисле неспособность визуализировать развитие органов в живом организме и практичности завершения масштабных генетических экраны. Данио рерио являются актуальными и полезными модельным организмом для изучения развития органов и моделирования болезней человека 45,46. В отношении болезней человека, функциональные гомологи у рыбок данио существует почти 70% всех генов человека 54,55.
Недавняя работа подчеркнули полезность данио для многих областей научных исследований почек 31,37,56. Исследования регенерации и ремонта у рыбок данио после AKI предположить, что регенерация трубочка эпителиальных и neonephrogenesis два процесса, которые происходят и перекрываются по всей регенерации timecourse 30,37. Использование аминогликозидный антибиотиков под названием гентамицин была использована в качестве травмы парадигмы, через которую можно изучать результаты AKI во взрослой данио 29,30,37. Над примерно двухнедельного периода после получения травмы от гентамицин, ближний TUBULэс регенерировать, а тем временем новые нефронов образуют по всей органа 29,30,37. В целом механизмы, которые регулируют регенерации эпителия остаются весьма спорным. В одном предлагаемом механизме процесса ремонта, есть исходное событие острое повреждение с последующим отторжением мертвых клеток в просвет. Далее, существует ряд де-дифференциации, пролиферации и миграции событий, после чего новые клетки дифференцироваться, репопулирующих травмированного базальную мембрану и восстановления функции потерпевшей сайте. Кроме того, другие исследования показали, что запасные клетки возникают из стволовых клеток / клеток-предшественников, которые находятся в пределах нефрона канальцев. Что касается процесса neonephrogenesis у рыбок данио, сотовые заполнители наблюдались следующий AKI на гентамицин инъекции 29,30. Эти агрегаты позже созревают в новых нефронов, что отвес в уже существующие канальцев 29,30. Общая нить, которая объединяет нефроне регенерацию эпителия и neonephrogenesis является их явная фактором тайна: в настоящее время существует экспоненциально больше вопросов о том, как эти регенеративные подвиги происходят, чем есть в наличии идеи.
На сегодняшний день, однако, несколько захватывающих линий доказательств поддерживают идею о том, что исследования почек регенерации с помощью данио может действительно обеспечить соответствующие сравнительные понимание человеческой AKI, что может также иметь прямое поступательное потенциальную 56-58. Химический анализ, чтобы определить малые молекулы, которые увеличивают пролиферацию почечных клеток-предшественников в эмбрионов рыбок данио недавно привело к идентификации деацетилаза ингибитор гистонов метил-4-(фенилтио) бутаноата (m4PTB) 56,57. Введение этого соединения к данио личинки с гентамицином-индуцированной ОПН показало, что выживаемость личинок увеличивается, и почечных канальцев, которые пролиферации была увеличена 56,58. Когда мыши с умеренной ишемией AKI лечили m4PTB, их восстановление было ускорено в доцтельная со снижением как трубчатой атрофии и клеточного цикла ареста пролиферирующих клетках почечных канальцев 58. Эти данные позволяют предположить, что проводники, отвечающие за нормальное данио почечной развития и / или регенеративного ответ на AKI будет сохраняться с млекопитающих 56.
Таким образом, в то время как необходимы дальнейшие исследования, чтобы дразнить друг от друга механизмы регенерации, а именно определить сигнальные пути, которые участвуют и понять их взаимодействия-данио предоставляет Одним из перспективных путей для достижения этой важной цели в области нефрологии. Такие инструменты, как нефрона клеточных меток, описанных в этом протоколе представляют одну группу анализов, которые могут быть использованы для оценки почечной состав и функциональность в модели Аки. Кроме того, они могут быть применены для характеристики трансгенных моделей заболеваний почек, и может обеспечить способы идентификации химических терапевтических средств, способных способствуя восстановлению структуры нефрона почек после плотинывозраст.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана финансирование в RAW из следующих: Национальные институты здоровья предоставляет K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О'Коннор Стартер Scholar гранта # 5-FY12-75; запуска средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук; и щедрый подарок в Университет Нотр-Дам от Элизабет и Майкл Галлахер от имени Галлахер семьи, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не было роль в разработке исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим штабы Отделения биологических наук за их поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся самоотверженность в помощи и благосостояния нашей данио колонии. Наконец, мы благодарим членов нашей исследовательской лаборатории для их комментарии, обсуждения и идеи по этой работе.
1X Pbs | Made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
1X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs. | ||
1X Pbs with 0.05 % Tween | 0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs. | ||
Tween 20 | American Bioanalytical | AB02038 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20°C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
Fine Forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
Glass Slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
Glass Coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
Modeling Clay | Hasbro | Playdoh | Other modeling clays can be substituted and work similarly |
Slide Holder | Thermo-Fisher | 12-587 | Optional: cardboard tray to store slides flat |
Bleaching solution | Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 100 μl of 20% Tween Fill to 20 mL with distilled water |
||
Potassium Hydroxide | Sigma | 221473 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | |
Blocking solution | Blocking Solution (for a 10 mL solution): 8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 2 mL of fetal calf serum 150 μl of DMSO |
||
Alkaline phosphatase activity detection | Invitrogen | E6601 | We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit. To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer's instructions. |
Alkaline phosphatase wash solution | Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 5 mL of 0.5M EDTA 120 mg of Levamisole 95 mL of 1X PBS |
||
Dextran, fluorescein, 40,000 MW | Invitrogen | D1844 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, cascade blue, 10,000 MW | Invitrogen | D1976 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW | Invitrogen | D1825 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW | Invitrogen | D1817 | Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20°C. |
Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine | Vector laboratories | RL-10-32 | DBA Staining Solution (for a 100 μl solution): 1 μl of DBA 99 μl of 1X PBS |
Propidium iodide | Invitrogen | E6601 | |
DAPI | Invitrogen | P1304MP | |
Vectashield Hard Set Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
Micro cover glass | VWR | 48393081 | |
Dimethyl Sulfoxide, DMSO | American Bioanalytical | 67-68-5 | |
Sucrose | Sigma | S0289 | |
EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502 | |
Levamisole | Sigma | L-9756 | |
Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences, Inc. | TFM-C | |
Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm | Sakura Finetek | 4565 | |
TruBond 380 Adhesive Microscope Slides | Tru Scientific | 0380W | |
Liquid Blocker – Super PAP Pen | Electron Microscopy Sciences | 71312 | |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen Scientific | 240-9020-Z10 | |
Cryostat | Therm | Microm™ HM 525 Cryostat | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |
Compound microscope | Nikon | 96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red | Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection. |