Summary

Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

Published: July 09, 2014
doi:

Summary

Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).

Abstract

Varicela zoster (VZV) es una causa importante de morbilidad y mortalidad después del trasplante de sangre de cordón umbilical (UCBT). Por esta razón, la profilaxis antiherpético se administra sistemáticamente a los destinatarios UCBT pediátricos para prevenir complicaciones asociadas con la infección por VZV, pero no existe un consenso fuerte, basada en la evidencia que define su duración óptima. Debido a inmunidad mediada por células T es responsable para el control de la infección por VZV, la evaluación de la reconstitución de respuestas de células T específicas de VZV siguiente UCBT podría proporcionar indicaciones en cuanto a si la profilaxis deben ser mantenidas o pueden ser interrumpidos. Para este fin, un interferón gamma específica de VZV (IFN-γ) inmunospot ligado a enzima (ELISPOT) ensayo fue desarrollado para caracterizar la producción de IFN-γ por los linfocitos T en respuesta a la estimulación in vitro con la vacuna de VZV viva atenuada irradiado. Este ensayo proporciona una medición rápida, reproducible y sensible de VZV C específicaELL inmunidad adecuada para el seguimiento de la reconstitución de la inmunidad específica de VZV en un entorno clínico y la evaluación de la respuesta inmune a los antígenos de VZV mediada.

Introduction

Por primera vez en 1989, UCBT se utiliza cada vez más como parte del tratamiento de diversos trastornos de la sangre neoplásicas y no neoplásicas en niños 1. VZV es un herpesvirus alfa humana citopático que hace que dos enfermedades diferentes de la varicela, (después de la infección primaria) y el herpes zóster (después de la reactivación). Después de la infección primaria, el VZV persiste durante toda la vida del huésped protegida dentro de los nervios sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal. Una de las complicaciones infecciosas más amenazantes siguientes UCBT se asocia con VZV 2-4. En nuestro centro clínico, en ausencia de profilaxis VZV, la incidencia acumulada de la enfermedad por VZV enfermedad VZV a los 3 años fue del 46% postUCBT 2. En estos pacientes, la infección de novo con o reactivación de VZV se asocia a menudo con la difusión visceral al sistema nervioso central, pulmones y el hígado 5-7. Como profilaxis resultado, aciclovir, valaciclovir o famciclovir se administra comúnmente UBDestinatarios CT 8,9. Sin embargo, esta estrategia de tratamiento no tiene en cuenta el potencial de protección de VZV linfocitos T específicos o la cinética de la reconstitución de las respuestas de células T específicas para VZV. Los problemas potenciales asociados con la expansión del uso de la profilaxis a largo plazo incluyen antiherpéticos a) sobretratamiento paciente; b) el desarrollo de resistencia a los medicamentos antivirales 10,11; y c) el deterioro de VZV reconstitución inmune específica 12,13. Dado que la detección de linfocitos T funcionales específicos de VZV se correlaciona con la presencia de la protección a largo plazo de la infección por VZV y el resultado clínico mejorado 4,14,15, el seguimiento de células mediada por las respuestas inmunes dirigidas contra VZV durante el período después del trasplante podría dar lugar a un uso más racional de antivirales tratamiento al permitir a los médicos a distinguir a los pacientes que se beneficiarían de VZV profilaxis de aquellos cuyo sistema inmunológico es capaz de controlar la replicación del VZV 4,13.

El ensayo ELISPOT de IFN-γ se utiliza ampliamente para las respuestas inmunes mediadas por células de vigilancia en una variedad de sistemas experimentales y las condiciones clínicas. Las manchas se generan después de la escisión de un sustrato cromogénico, la generación de un precipitado visible y estable en el sitio de la reacción. Cada foco de ese modo representa la huella de una célula productoras de citoquinas individuales. IFN-γ ELISPOT no sólo mide la capacidad de las células individuales ex vivo para producir IFN-γ en respuesta a la estimulación in vitro con antígeno afín, sino que también proporciona una estimación de la frecuencia de responder las células en una población de células dada 16,17. Además de su alta sensibilidad, IFN-γ ELISPOT es sencillo de realizar, haciendo su uso posible en el contexto de protocolos clínicos personalizados destinados a guiar la iniciación o el cese del tratamiento antiviral. El procedimiento se detalla a continuación describiendoES un ensayo ELISPOT que está diseñado específicamente para detectar y medir la producción de IFN-γ por las células mononucleares de sangre periférica después de la estimulación in vitro con antígenos de VZV derivados.

Protocol

Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética del CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canadá, donde se realizó el estudio. El consentimiento informado se solicitó y obtuvo de todos los participantes en el estudio, sus padres o tutores legales. Todos los procedimientos realizados en los días 1 y 2 deberán llevarse a cabo en condiciones estériles (es decir, bajo una campana de flujo laminar). Procedimientos de seguridad estándar para la manipulación de s…

Representative Results

El protocolo de ELISPOT de IFN-γ se detalla más arriba fue desarrollado y optimizado en nuestro laboratorio para medir la magnitud y la calidad de las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra VZV 4. Diversas fuentes de antígeno de VZV se pueden utilizar para la etapa de estimulación. Estos incluyen: a) de detergente disponible comercialmente extractos inactivadas de VZV infectaron células Vero 18; b) piscinas de péptidos sintéticos superpuestos de proteínas de VZV codificad…

Discussion

Modificaciones y solución de problemas: los ensayos de IFN-γ ELISPOT se han utilizado para examinar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra una variedad de patógenos microbianos, incluyendo virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) 24,25, virus de la hepatitis C (VHC) 26, 27, y Mycobacterium tuberculosis 28,29, sólo para nombrar unos pocos. Aquí describimos el desarrollo de un ensayo ELISPOT IFN-γ para medir la inmunidad celular contra, con …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a los participantes del estudio y sus padres. También nos gustaría dar las gracias a la Dra. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para el acceso a su lector ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para el análisis estadístico, y Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois y Martine Caty como experto técnico ayuda. Con el apoyo de subvenciones de Le Fonds d'opération pour les projets de recherche clinique et d'Evalution des tecnologías (CHU Sainte-Justine) a HS y PO, por la Fundación Centro de cancérologie Charles-Bruneau, y por la Sociedad de Leucemia y Linfoma de Canadá. ISF fue apoyado por becas de la Fundación CHU Sainte-Justine y le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG fue el destinatario de becas del Departamento de Microbiología, Infectología e Inmunología, Universidad de Montreal (Gabriel-Marqués de Becas), FRQS, y los Institutos Canadienses de Salud Iesearch (CIHR). NM fue apoyado por la Fundación CHU Sainte-Justine, la Fundación Cole y FRQS.

Materials

Leucocep tube VWR 89048-936/89048-932 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. 
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-1440-02 Protect from light.
Benzonase nuclease Novagen 70746-3 Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate Millipore MSIPS4W10 Sterile with pore size of 0.45 µm. 
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody BD Biosciences 551221 NIB42 clone. 
Pepmix VZV IE63  JPT Peptide Technologies PM-VZV-IE63 Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody BD Biosciences 554550 4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase  Bio-Rad Life Science 170-3554 Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT Bio-Rad Life Science 170-6432 Protect from light.

References

  1. Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
  2. Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
  3. Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
  4. Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
  5. Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
  6. Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
  7. Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients – a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
  8. Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation–a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
  9. Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
  10. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  11. Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
  12. Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
  13. Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
  14. Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
  15. Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
  16. Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
  17. Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
  18. De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
  19. Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
  20. Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
  21. Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
  22. Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
  23. Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
  24. Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
  25. Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
  26. Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
  27. Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
  28. Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
  29. Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
  30. Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
  31. Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
  32. Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  33. Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
  34. Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
  35. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
  36. Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
  37. Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
  38. Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
  39. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  40. Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
  41. Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
  42. Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
  43. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
  44. Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
  45. Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
  46. Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
  47. Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
  48. Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).

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Salem Fourati, I., Grenier, A., Jolette, É., Merindol, N., Ovetchkine, P., Soudeyns, H. Development of an IFN-γ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation. J. Vis. Exp. (89), e51643, doi:10.3791/51643 (2014).

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