Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em> In situ</em> Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren
Summary
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen.
Abstract
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die molekularen Nachweis von Nukleinsäuren in Zellen ermöglicht. FISH DNA ist oft in der Zytogenetik und Krebsdiagnostik verwendet und können Aberrationen des Genoms, die oft wichtige klinische Auswirkungen erkennen. RNA-FISH können verwendet werden, um RNA-Moleküle in Zellen zu erfassen und wichtige Einblicke in die Regulation der Genexpression zur Verfügung gestellt. Die Kombination von DNA-und RNA FISH innerhalb der gleichen Zelle ist technisch anspruchsvoll, da die Bedingungen für DNA-FISH vielleicht zu hart für zerbrechlich, einzelsträngige RNA-Moleküle sein. Wir präsentieren hier eine leicht anwendbare Protokoll, das die kombinierte, simultane Detektion von Xist RNA und DNA von den X-Chromosomen kodiert ermöglicht. Diese kombinierte DNA-RNA-FISH-Protokoll kann wahrscheinlich andere Systeme, bei denen sowohl RNA und DNA nachgewiesen werden müssen aufgebracht werden.
Introduction
Studieren Zellen und Gewebe mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat sich seit ihrer Einführung in den späten 1970er Jahren ein, konnten die Forscher um Gene, Chromatin-Organisation und Genexpression auf subzellulärer Ebene zu studieren. DNA-FISH wird häufig in Zytogenetik, Karyotypisierung 2, 3 und Krebsdiagnostik Präimplantations-Screening-4 verwendet wird, und hat eine wichtige Rolle in der Molekularforschung 6.5, da es die Detektion von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung ermöglicht. Einzelzell-Expressionsanalyse von RNA-FISH können native primären Transkripte zu erkennen und nicht-kodierenden RNAs transkribiert Chromosomen aus und bietet Vorteile gegenüber anderen Techniken, die Genexpression auf Bevölkerungsebene Einschätzung liegen, wie beispielsweise quantitative RT-PCR, genomweite Expressionsanalyse oder Northern Blot . Durch die Visualisierung RNA-Transkripte, die direkt aus ihren Ursprungsorten hat es zum Beispiel gewesen,bemerkt, dass die Genexpression stochastischen 7, und kann manchmal allelspezifische 8 sein. Verbesserungen in der Technik sogar erlaubt den Nachweis und die Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle innerhalb von Zellen 9-11.
Das Grundprinzip besteht aus FISH-Hybridisierung von Nukleinsäuren in der Zelle zu einer Nukleinsäuresonde mittels hochspezifische Watson und Crick Basenpaarung. Die Sonde kann entweder direkt oder indirekt erfasst, was zu einem Signal, das mikroskopisch sichtbar gemacht werden kann. Anfängliche Versuche bestand aus radioaktiv markierten Sonden, die Nachteile der Grundlage von Sicherheitsfragen, begrenzte räumliche Auflösung und die Fähigkeit, nur ein Ziel zu einer Zeit zu erfassen 12-14 hatten. Die weitere Entwicklung der nicht-radioaktiven Labels, darunter Fluorochrome, Haptene, und Enzyme, hat die weit verbreitete Nutzung von FISH als Routine Molekularbiologie Technik erlaubt. Die FISH-Sonde kann entweder direkt mit fluoroch gekennzeichnet werdenromes durch chemische Verknüpfung der Fluoreszenzmoleküle an Nukleinsäure-Sequenzen 15 und die Integration der fluoreszierend markierten Nucleotide 16-19, oder die Sonde kann indirekt nach Integration Haptene (wie Biotin und Digoxigenin) und immunologischen Nachweis von Haptenen durch Hapten spezifischen Antikörper konjugiert visualisiert fluoreszierenden Reportermoleküle 20-21. Der letztere Ansatz erlaubt eine Signalverstärkung durch die Verwendung mehrerer Schichten aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die verwendet werden, um das ursprüngliche Signal zu verstärken, und ermöglicht den Nachweis von RNA-Spezies, die auf niedrigem Niveau exprimiert werden. Durch die Kombination von direkten und indirekten Markierungstechniken und verschiedene Haptene können mehrere Ziele gleichzeitig innerhalb der gleichen Zelle sichtbar gemacht werden.
Einer der wichtigsten Schritte bei der FISH-Protokolle ist die Hybridisierung der Sonde an ihr Ziel. Obwohl in der Theorie, eine Sonde zu binden, die spezifisch nur an sein Ziel in der Praxis diese Spezifitätist nicht immer erreicht, da Sonden, um homologe Regionen binden und Hybridisierungsbedingungen nicht immer ideal für eine bestimmte DNA-Region oder RNA Spezies. Post-Hybridisierungswaschanlagen sind daher von besonderer Bedeutung, da sie die Stringenz der FISH-Verfahren zu erhöhen, und kann nicht-spezifische Bindung von FISH-Sonden, die in einem hohen Pegel von Hintergrundrauschen führen würde. Wie RNA-Moleküle werden Einzelstrang können sie leicht zu einer FISH-Sonde hybridisiert werden. Im Gegensatz dazu benötigt das doppelsträngige DNA-Molekül einen ersten Denaturierungsschritt, wonach eine Sonde hybridisieren kann. Dies wird normalerweise durch Erhitzen der Probe, die Denaturierung der DNA Ergebnisse erzielt. Doch unter diesen harten Bedingungen kann zerbrechlich, einsträngige RNA-Moleküle verloren. Daher kombinierten DNA-RNA-FISH erfordert erhebliche Optimierung der Bedingungen und ist technisch anspruchsvoll gegenüber der getrennten Erkennung von nur RNA oder DNA.
Hier haben wir Präsentationta detailliertes Protokoll der kombinierten, gleichzeitigen DNA-RNA-FISH, die uns erlaubt hat, X-Chromosom-Inaktivierung (XCI) bei der Differenzierung von weiblichen Maus embryonale Stammzellen 22-24 studieren. XCI ist ein entscheidender epigenetischen Mechanismus für weibliche Embryonalentwicklung 25 und führt heterochromatinization und somit Silencing eines der beiden X-Chromosomen in weiblichen Individuen 26-27. Wesentlich für dieses Verfahren ist die nicht-kodierende RNA Xist 28-30, die durch die RNF12 22-23 und 24 REX1 Proteine reguliert wird. Xist Expression wird über die Zukunft inaktiven X-Chromosom (Xi) während der embryonalen Entwicklung oder bei der ES-Zelldifferenzierung in vitro hochreguliert und kann entlang der X-Chromosom verteilt und dadurch gewinnen Chromatin Remodeling Enzyme, die in der Transkriptionsherunterfahren des X-Chromosoms 31 führen. Diese Ausbreitung Xist RNA durch RNA-FISH als Beschichtung des X-Chromosom visualisierteinige, die auch als Xist Wolke bezeichnet wird. Da weibliche ES-Zellen können einem ihrer X-Chromosomen durch genomische Instabilität zu verlieren, wir und andere kombinierte DNA-RNA-FISH eingesetzt haben, XCI zu untersuchen, um sicherzustellen, dass nur karyotypisch stabile Zellen werden in der Analyse dieses wichtigen Prozesses 22,32 bewertet -34. Wie in jedem molekularbiologischen Technik haben mehrere ausgezeichnete Protokolle veröffentlicht 35-38. Hier präsentieren wir unsere Methode, ausgehend von der Induktion der Differenzierung in Maus-ES-Zellen, Fixierung von Zellen, die Kennzeichnung von FISH-Sonden durch Nick-Translation, Vorbehandlung von fixierten Zellen zu ermöglichen Permeabilisierung und anschließender Sondenaufnahme, Hybridisierung der Sonde an die Ziel und schließlich Detektion der Sonde durch Fluoreszenz-markierten Antikörpern. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Gläubigen Erkennung von Xist RNA und das X-Chromosom innerhalb einer Frist von zwei Tagen, und die Grundlagen dieser Technik kann wahrscheinlich angepasst werden otihre Systeme und Forschungsbereiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kombinierte DNA-RNA-FISH technisch eine Herausforderung sein, die Bedingungen für DNA-FISH können zu hart für weniger stabile RNA-Moleküle sein. Es wurden verschiedene Ansätze angewendet, um sowohl DNA als auch RNA in einer Zelle zu untersuchen, unter Umgehung der Notwendigkeit einer gleichzeitigen Inkubation mit Sonden Erfassen sowohl der DNA und RNA. Beispielsweise in einer Überlagerungsansatz wird zuerst RNA-FISH durchgeführt, und die Zellen abgebildet werden, und die Koordinaten genommen werden. Anschließend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
Materials
| female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
| mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
| ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
| ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
| cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| falcon tubes | Falcon | 352196 | |
| 24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
| absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
| RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
| sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
| biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| sterilized cotton | |||
| eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
| formamide | Acros organics | 3272350000 | |
| dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
| HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
| object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
| 10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
| denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2M Tris pH 7.5 solution | |||
| Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
| 10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
| Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
| BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
| rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
| donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| nail-varnish | |||
| fluorescent miscroscope |
References
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