Данио эмбрион является отличным примером для биологии развития исследований. Во время эмбриогенеза, данио развивать с желтком массы, которая представляет трехмерные проблемы для наблюдения и анализа проб. Этот протокол описывает, как создать двумерные плоские монтирования препараты всей горе на месте (WISH) окрашенные данио образцов эмбрионов.
Данио эмбрион настоящее время широко используется для основного и медико-биологических исследований, чтобы исследовать генетического контроля процессов развития и моделировать врожденные аномалии. В течение первого дня жизни, данио эмбриона проходит через множество этапов развития, включая внесение удобрений, расщепление, гаструляции, сегментации, и органогенеза структур, таких как почки, сердце и центральную нервную систему. Анатомия молодой эмбрионов рыбок данио представляет несколько проблем для визуализации и анализа тканей, участвующих во многих из этих событий, потому что эмбрион развивается в связи с круглой массы желтка. Таким образом, для точного анализа и визуализации экспериментальных фенотипов в основной эмбриональных образцов между хвостовой почки и 20 сомитов (10 и 19 часа после оплодотворения (HPF), соответственно), такие как те, окрашивали с использованием установки в целом в гибридизация (по желанию), он Часто желательно удалить эмбрион от желтка бвсе и позиционировать его плашмя на предметное стекло. Однако, выполняя плоскую процедуру монтирования может быть утомительным. Таким образом, успешным и эффективным плоским смонтировать препарат значительной степени способствовать путем наглядной демонстрации техники рассечение, а также помогли с помощью реагентов, которые помогают в оптимальной обработки ткани. Здесь мы предоставляем наш протокол WISH для обнаружения одного или двух цветов экспрессии генов в данио эмбриона, и продемонстрировать, как в квартиру процедура монтажа может быть выполнена на этом примере, окрашенных неподвижного образца. Эта квартира протокол монтаж широко применима к изучению многих эмбриональных структур, которые возникают в период раннего данио развития, и могут быть реализованы в сочетании с другими методами окрашивания, выполненных на образцах фиксированных эмбрионов.
Данио, Данио рерио, стала широко использоваться организмом в изучении биологии развития. Данио рерио являются тропические, виды пресноводных позвоночных, принадлежащих к семейству карповых. Данио рерио были первоначально использовались для экологических исследований, чтобы получить информацию об опасности потенциальных загрязнителей воды, так как они были легко доступны, недороги, и просты в обслуживании 1. За последние тридцать лет, данио стал признан как генетически послушный позвоночных модельной системы для хозяина причин. Данио рерио показывают высокий уровень анатомической и физиологической сохранения с высших позвоночных, включая млекопитающих 2,3. Последние аннотации последовательность генома показал, что около 70% генов человека есть хотя бы один данио коллегу 4. Например, многие ортологичных гены, которые играют важную роль во время развития почек были определены между этими видами 5-7. Это драхор степень сохранности в отношении клеточной и молекулярной биологии позволило исследователям создавать модели для широкого круга заболеваний человека в данио 8, и рыбок данио стали ценным инструментом для выявления потенциальных лекарственной терапии с использованием химических генетические экраны 9.
Кроме того, модель данио не только в состоянии повторять разнообразные сложные процессы развития и болезненных состояний, которые замечены у людей, но несколько дополнительных атрибутов также повысить свою привлекательность в качестве модельного организма для эмбриологических исследований. Данио рерио яйцекладущие и воспроизводить через вещания нереста, который обеспечивает исследователей с легким доступом к эмбрионов от начала оплодотворения 10. Другие преимущества включают в себя размер эмбриона, прозрачность и быстрый, внешний развитие 10. Кроме того, данио взрослых обладают высокой плодовитостью и обычно производят относительно большие сцепления размеры, которые могут варьироваться между 200-500в неделю, в конечном счете, позволяет исследователям выполнять высокие эксперименты пропускную способность, такие как фенотипа основе химических экранов, с легкостью 9.
Тем не менее, несмотря на множество преимуществ, которые выставлены на данио модели, существуют проблемы, которые относятся к анализу и коммуникации экспериментальных результатов, полученных из ранних стадий развития. В некоторых случаях, присущие анатомия данио эмбриона может заслонить визуализацию своих данных. После оплодотворения, начальная клетка подвергается несколько событий расщепления по ходу развития 11. После гаструляции, эмбриональная ось возникает на стадии хвостовой почки (10 HPF) так, чтобы он, обернутой вокруг желтка 11. По мере прогрессирования последующее развитие через сегментации период, ствол будет расти в массы, а также удлинить осевым удлинением таким образом, что хвост вместе с частью желтка мешок себе простираются от центральной массы желтка11. Между хвостовой почки и 20 сомитов стадии (19 HPF), попытки наблюдать специфические особенности развития после использования различных протоколов окрашивания, такие как желание, может быть сложным и визуализировать и сфотографировать из-за геометрии эмбриона и непрозрачности желточный мешок. Один из способов устранить эти проблемы заключается в удалении желток, а затем сгладить эмбрион в двумерной образца, который может быть проанализирован в более простым способом.
Следующие ресурсы протоколов и видео обеспечивают руководство о том, как успешно deyolk и помещения смонтировать эмбрион следующее фиксации и окрашивания, на примере одного или окрашивания WISH двухцветной. WISH является широко используемым методом, который позволяет обнаруживать конкретных нуклеиновых кислот в консервированных образцов и таким образом позволяет сайт (ы) экспрессии генов, которые будут обнаружены в ткани. Методы WISH широко описаны и могут быть выполнены с различными цветовыми подложек, а также гриппorescent системы обнаружения 12-20. Здесь мы предлагаем наш модифицированный протокол WISH, используемый для эмбрионов данио между хвостовой почки и сегментации стадиях развития. Альтернативные протоколы WISH, однако, совместимы с плоской процедуры монтирования описанной здесь, как отмечалось в начале следующей протокола. Кроме того, плоская монтажная могут быть использованы в сочетании с любым количеством существующих методов визуализации, таких как всей горе иммуногистохимии или клеточной линии отслеживания меток, которые не описаны в данном протоколе. В целом, методика плоской монтажа может лучше включить превосходную анализ и представление данных, полученных в результате экспериментов с самых ранних этапов эмбрионального развития в рыбок данио.
Данио рерио оказались чрезвычайно ценным модельный организм в течение всего исследовательского сообщества в последние годы. Данио рерио проявляют значительную степень сохранения генетических ресурсов с тем из высших позвоночных, и преимущества, связанные с их анатомии, разведения и жизненного цикла сделать этот вид очень поддаются экспериментальных исследований. Кроме того, продвижение молекулярных методов, применимых к данио еще больше способствовало использование этого модельного организма в научных исследованиях. Например, большое разнообразие трансгенных данио линий были получены для изучения прогрессирования заболевания и ответить на многие фундаментальные вопросы, которые лежат ключевые механизмы развития, включая органогенеза.
Соответственно, на основе динамического использования данио как в болезни и исследований развития, маркировки клеток методологии и сигнал количественное являются одним из важнейших аспектов анализа данных. В то время как методы, которые используют люминесцентные апtibodies может быть использован для обнаружения экспрессии белка в трансгенных данио, исследователи, как правило, полагаются на стандартные процедуры, как WISH 12-16 изучить пространственно-временной локализации транскриптов гена в фиксированном, нетрансгенной данио образца. На самом деле, ЖЕЛАНИЕ является одним из наиболее широко используемых методов в биологии 16, и является жизненно важным инструментом используется для характеристики фенотип генетических мутаций и химических генетических возмущений. Тем не менее, жаль, что связано с рядом потенциальных ловушек и проблем. Чтобы подтвердить специфичность антисмысловой ribroprobe, смысловые рибозонды могут быть использованы в качестве контроля для оценки специфичности антисмысловой рибозонд шаблонов окрашивания. В то время как разделы 4 и 5 представлены в порядке маркировки и обнаружения дигоксигенином-меченного зонда с последующим флуоресцеина-меченным зондом, этот порядок может быть отменено. Как правило, более слабые сигналы (гены с более низкими уровнями экспрессии) лучше всего обнаружены с дигоксигенином-меченных зондов и этого пятнаразработан первый с фиолетовым подложке, после чего обнаружения и окрашивания более сильным сигналом (с избытком выразил генов) с помощью красную подложку. Однако, если двухцветные реакции будут выполнены, то рекомендуется, что различные комбинации этикеток и субстратов проверяются, чтобы найти процедуру, которая больше всего подходит для сбора и анализа данных. Кроме того, раз это предусмотрено блокирование, инкубацию антител и промывки, представленную в разделах 4-5 приспособлены для эмбрионов в возрасте до 24 ч после оплодотворения; длительные интервалы этих же шагов со взрослыми эмбрионов может привести к накоплению солей на образец. Обширные советы по устранению неполадок стандартный данио эмбрионов WISH уже описаны в литературе 12-16. Вероятно, наиболее общие дилеммы является высокий фон. Мы рекомендуем увеличить количество MABT моет в шаге 4,7 до 15-20 стирок при необходимости, хотя, по нашему опыту добавление ночной MABT 'супер-стирки "дает выдающиеся результаты при использовании в сочетании с 10 или более коротких MABT моет перед переходом к шагу 4.8. Другой пример дилемма плохое проникновение зонда, который может произойти с длительным рибонуклеотидных. Стрижка в рибозонд следующем шаге 3.6 через щелочного гидролиза может противодействовать этому. По нашему опыту с молодыми образцов, зонд сдвига обычно не требуется. Тем не менее, следует иметь в виду, что такие параметры, как это может быть способствующие факторы в исходе эксперимента желание, и мы предлагаем экспертизу этих полезных инструкций по устранению неполадок уже публично доступных в сообществе по мере необходимости для уточнения экспериментальные параметры для WISH в свой собственный Исследование 12.
В дополнение к традиционным методам WISH 12-16, имело место постоянное появление достижений в WISH методологий и альтернативных протоколов, которые были сформулированы. Они включают новые способы обнаружения сигнала, например, с использованием флуоресценциилюминесценции 17-19, к методам, которые позволяют локализацию микроРНК 20. Тем не менее, несмотря на множество улучшений, которые были сделаны с существующими методами маркировки клеток, эффективность этих процедур отрицаются если пятно (ы) не могут быть легко визуализированы в образце интереса в нужной точке времени. Это ограничение является проблематичным для исследователей особенно когда она относится к ранних эмбриональных стадиях данио онтогенеза, который потенциально может привести к пробелам в нашем понимании различных процессов развития, которые возникают в это время. Во время нормального развития данио, желточный мешок будет постепенно уменьшаться в размерах по мере старения эмбриона 11. Таким образом, на этих более поздних стадиях развития (> 24 часа после оплодотворения), окрашивание WISH довольно проста для анализа, потому что эмбрион больше по сравнению с прилегающей желточного мешка. Однако, это не тот случай со сцены хвостовой почки в начале сомитогенеза (когда эмбриональныемасса расположена вокруг желтка), где непрозрачная желток может иногда скрывать визуализацию пятно. Следовательно, метод плоской монтажа была разработана, чтобы помочь облегчить визуализации и анализа данных проблем, связанных с характеристикой ранних данио образцов эмбриона (схематизированных в рисунках 1 и 2), и был широко использован с систематической фенотипирования генетических мутаций изолированных с первых крупномасштабных генетических экранов 21.
С появлением техники плоским монтажа, анализ ранних стадиях развития была значительно улучшена. После того, как желток удаляется из эмбриона, можно заложить квартиру эмбриона на предметное стекло в желаемой ориентации для работы с изображениями. Это двумерный положение позволяет просматривать весь эмбриона сразу, что избавляет от необходимости вращать образец. Многочисленные ткани расположены в широких областях эмбриона, например,предшественники, которые формируют кровь и почки. Кроме того, один, возможно, потребуется, чтобы сравнить несколько различных развивающихся тканей в одно время. Плоская монтажная позволяет исследователю одновременно просматривать всю область таких клеточных групп, и, таким образом может очень помочь количественными такие как измерения площади для ткани или клеток пунктам. Этот метод, в конечном счете помогли привести ко многим открытиям, касающимся целый ряд важных механизмов развития, лежащих в основе кроветворение, нейрогенез и органогенез. Таким образом, после освоения, заявки на этот простой метод для исследователей весьма существенны.
Например, в исследовании, рассматривая клонов выбор во кроветворения, плоским смонтировать препараты эмбрионов данио на сомитных стадиях (SS) 14 и 18 были использованы для иллюстрации изменения, которые произошли в паттерне экспрессии в PU.1 цинка фактора палец транскрипции между дикого типа и GATA1 морфолино вводят эмбрионов 22.Этот метод позволил обнаружить расширенной области PU.1 при 18 сс, указывая, что GATA1, скорее всего регуляции экспрессии PU.1 в промежуточной клеточной массы (ICM) вокруг этот момент времени. Установлены Дополнительная плоским эмбрионы окрашенные для различных эритроидных генов, включая gtpbp1 и epsin продемонстрировал убыток в экспрессии этих генов в VLT мутантов, которые были GATA1 – / -. Дальнейший анализ не показал никаких изменений в экспрессии генов erythoid как biklf и testhymin, которые были, как известно, зависит от Гата деятельности. Таким образом, в сочетании с их других экспериментальных результатов было выявлено, что GATA1 имеет важное значение в регулировании дифференцировки клеток в пределах миело-эритроидных линии. В исследовании развития нервного гребня, плоские опоры были использованы для изучения экспрессии Crestin в Монблан (моб M610) мутантов в исследованииизучение роли Монблан и функции генов tfap2a 23. На 10 и 20 сс, выражение Crestin был полностью отменен в голову и была снижена в багажнике области толпы M610 мутантов по сравнению с нормальной экспрессии дикого типа, в конечном счете, помощь этой группе сделать вывод о важности Монблан и tfap2a регулирования при формировании нервного гребня. Кроме того, с точки зрения органогенеза, плоские крепления позволили открытие присутствии различных областях в начале почечной области предшественников во время развития данио почек эмбриона, известный как предпочки. Данио эмбрион обеспечивает консервативный и в то же анатомически простой системы для изучения того, как почечные предшественники привести к нефрона функциональных блоков, которые составляют предпочки, процесс, известный как нефрогенеза 6,7 (рис. 4). Квартира смонтировать анализ была полезна для документов областях реNAL предшественники и рассекать на исход изменений в сигнализации РА во предпочки паттерна 6,7 (рис. 5), которая ранее была неизвестна. Взятые вместе, эти примеры показывают, что на самом деле есть много широкое применение для этой квартире установить протокол в изучении разнообразных процессов, которые происходят во время нормального развития и больных государств.
Концептуально, эта квартира процедура монтажа довольно прост в целом. Тем не менее, манипуляции и степень изящества необходимые освоить этот метод может быть довольно сложным в освоении в отсутствие наглядной демонстрации. Таким образом, этот протокол был составлен для того, чтобы исследователи, особенно новички в данио модели, с возможностью, чтобы лучше понять, как выполнять эту технику и делиться нашим советам на реагенты, которые могут оптимизировать обработку тканей. Мы надеемся, что этот протокол, в конечном счете позволить другим в сообществе уточнить наиболее идеальные условия выборки, чтобы быть уСЭД для премиум изображений, анализа данных и связи их результатов в публикациях. В конечном счете, это должно позволить исследователей преодолеть анатомические препятствия на данио во время раннего эмбриогенеза, которые могут затенить представление результатов эксперимента, и решить эти за счет использования этой простой, но значительного техники.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана финансирование в RAW от каждого из следующих: NIH гранты K01 DK083512, DP2 OD008470 и R01 DK100237; Марш Dimes Василий О'Коннор Стартер Scholar предоставления гранта № 5-FY12-75; запуска средства из Университета Нотр-Дам колледж науки и Отделения биологических наук. Мы особенно хотели бы поблагодарить Элизабет и Майкл Галлахер, вместе со всей Галлахер семьи, который передал щедрый подарок в Университет Нотр-Дам, чтобы способствовать исследования стволовых клеток. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбор и анализ данных, решение о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим штабы Отделения биологических наук за их поддержку, и Центр данио рерио исследований в Нотр-Дам за их выдающуюся преданность в обслуживании и благосостояния нашей данио колонии. Наконец, мы благодарим членов нашей исследовательской лаборатории для своих комментариев, дискуссий и идеи по этой работе, кака также календулы (Maripooka) и Zinnia Wingert для обеспечения естественно пролить кошачьих усов, чтобы сделать самые превосходные инструменты ресниц для нашего исследования.
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
1 X Pbst | 0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water. | ||
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
4% PFA/1X Pbs | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1L filter system, 0.45 um CA |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C. |
HYB+ | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin | ||
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
MAB | 2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
MABT | MAB + 0.1% Tween-20 | ||
block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C—if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
staining solution-purple | For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
staining solution-red | For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).. | ||
NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water. |
INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted |
slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
compound microscope | Nikon | 80i, 90i |