الصدمة الحادة الدماغ في الفئران تليها الطولية التصوير ثنائي الفوتون
Summary
الصدمة الدماغ الحاد هو إصابة الشديدة التي لا يوجد لديه العلاج المناسب حتى الآن. Multiphoton المجهري يسمح دراسة طوليا عملية التنمية الصدمة الدماغ الحادة وسبر الاستراتيجيات العلاجية في القوارض. وأظهرت نموذجين من الصدمة الدماغ الحادة درس في الجسم الحي مع اثنين من الفوتون التصوير من الدماغ في هذا البروتوكول.
Abstract
على الرغم من الصدمة الدماغ الحادة غالبا ما ينجم عن تلف الرأس في حوادث مختلفة ويؤثر على جزء كبير من السكان، لا يوجد علاج فعال لذلك حتى الآن. القيود المفروضة على نماذج حيوانية المستخدمة حاليا تعيق فهم آلية الأمراض. Multiphoton المجهري يسمح دراسة الخلايا والأنسجة داخل أدمغة الحيوانات سليمة طوليا في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا، نحن تصف نموذجين من إصابات الدماغ الحادة درس عن طريق التصوير ثنائي الفوتون من السلوك خلايا الدماغ في ظل ظروف ما بعد الصدمة. وأصيب المنطقة من المخ اختيارها بإبرة حادة لإنتاج الصدمة بعرض للرقابة وعمق في لحمة الدماغ. يستخدم أسلوب لدينا وخز التجسيمي مع إبرة حقنة، والتي يمكن دمجها مع التطبيق المتزامن المخدرات. نقترح أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أداة متقدمة لدراسة الآليات الخلوية من العواقب المرضية في جسم المريض من صدمة حادة في الدماغ في الثدييات <em> في الجسم الحي. في هذا الفيديو، ونحن الجمع بين إصابات الدماغ الحادة مع اثنين من الاستعدادات: الجمجمة الجمجمة النافذة ورقيق. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود كل من الاستعدادات لتصوير مراحل متعددة من تجديد الدماغ بعد الصدمة.
Introduction
إصابات الدماغ الحادة مشكلة صحية عامة كبيرة مع ارتفاع معدل الإصابة في حوادث السيارات، والسقوط أو الاعتداءات، وارتفاع معدل انتشار الإعاقة المزمنة لاحقة. يبقى النهج العلاجي لعلاج إصابات الدماغ أعراض تماما، مما يحد من فعالية الرعاية قبل دخول المستشفى والجراحية والحرجة. وهذا يجعل الأثر الاجتماعي والاقتصادي للإصابات الدماغ الحادة بشكل خاص. لمجموعة متنوعة من الأسباب، فإن معظم التجارب السريرية لم تثبت تحسنا في الانتعاش بعد إصابات الدماغ باستخدام أساليب علاجية جديدة.
النماذج الحيوانية ذات أهمية حاسمة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة نحو مرحلة حيث يمكن التنبؤ نجاعة الأدوية في المرضى الذين يعانون من إصابات في المخ. في الوقت الحاضر، العديد من النماذج الحيوانية راسخة من صدمات الرأس موجودة، بما في ذلك تأثير تسيطر القشرية 1، السائل إصابة قرع 2، تشوه القشرية ديناميكية 3، الوزن الإفلات4، وإصابة 5 الصورة. وقد استخدمت عدد من نماذج تجريبية لدراسة بعض الجوانب الشكلية والجزيئية والسلوكية للرئيس علم الأمراض المرتبطة الصدمة. ومع ذلك، لا يوجد نموذج حيوان واحد هو ناجحة تماما في التحقق من صحة استراتيجيات علاجية جديدة. تطوير نماذج حيوانية يمكن الاعتماد عليها، والتي تسيطر استنساخه من إصابات الدماغ هو ضروري لتقييم العمليات المرضية المعقدة.
مزيج رواية من أحدث تقنيات التصوير المجهري وصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا يوفر فرصة غير مسبوقة لتحقيق في جميع مراحل إصابات الدماغ، والتي تشمل الإصابة الأولية، وانتشار الإصابة الأولية والإصابة الثانوية، والتجدد. على وجه الخصوص، في الجسم الحي اثنين من الفوتون المجهري هو التكنولوجيا البصرية غير الخطية الفريدة التي تسمح التصور في الوقت الحقيقي من الهياكل الخلوية وحتى التحت خلوية في الطبقات القشرية العميقة من الدماغ القوارض. عدة أنواع من الخلايا وورشولا يمكن تصوير nelles في وقت واحد من خلال الجمع بين علامات الفلورسنت مختلفة. باستخدام هذه الأداة القوية، يمكننا تصور التغيرات المورفولوجية والوظيفية الحيوية في الدماغ يعيشون في ظل ظروف ما بعد الصدمة. وقد أظهرت مزايا في الجسم الحي اثنين من الفوتون المجهري في دراسة إصابات الدماغ مؤخرا كيروف والزملاء 6. باستخدام نموذج كدمة خفيفة التنسيق القشرية، أظهر الباحثون أن هذه الإصابة شجيري الحاد في القشرة pericontusional وبوابات من انخفاض في تدفق الدم المحلية. وعلاوة على ذلك، فإنها أظهرت أن القشرة للخطر عملية الأيض حول الموقع كدمة تلف مزيد من الاستقطاب الانتشار. هذا الضرر الثانوي يؤثر الدوائر متشابك، مما يجعل عواقب إصابات في الدماغ أكثر شدة.
هنا، نقترح طريقة وخز التجسيمي مع إبرة حقنة، والتي يمكن أن تكون مجتمعة في وقت واحد مع تطبيق المخدرات الموضعية، كنموذج متقدم للدماغ المحليةإصابة وكأداة لدراسة العواقب المرضية في جسم المريض من الصدمة الحادة في الدماغ في الثدييات في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الصدمة الدماغ هو، لا يمكن التنبؤ بها الحدث المفاجئ. هنا، نحن تصف نموذج الحيوان الذي يستنسخ مجموعة من التغيرات المرضية التي لوحظت في المرضى من البشر بعد إصابات الدماغ مثل التنكس العصبي، والقضاء على التشعبات، وذمة الدماغ، ندبة الدبقية، نزيف في قشرة الدماغ إلى جانب نز?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للغاية للدكتور فرانك كيرشوف لتوفير GFAP-EGFP وسلالات الفئران CX3CR1-EGFP. وأيد العمل من المنح المقدمة من مركز الحراك الدولي من فنلندا، تيكيس، كلية الدراسات العليا الفنلندية العلوم العصبية (FGSN) وأكاديمية فنلندا.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
