توضح هذه المقالة طريقة لتوليد أجنة خيالية التي تم تصميمها لاختبار المساهمات أنواع محددة من قمة العصبية و / أو الأنسجة الأخرى في التنمية القحفي.
توليد أجنة خيالية هو نهج واسع النطاق وقوية لدراسة مصير الخلايا والتفاعلات الأنسجة، والمساهمات أنواع محددة إلى النسيجي والتنمية المورفولوجية للأجنة الفقاريات. على وجه الخصوص، وقد أنشأت استخدام الأجنة خيالية على أهمية قمة العصبية في توجيه التشكل أنواع محددة من مجمع القحفي. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم اثنين من أنواع الطيور والبط والسمان، مع مختلف بشكل ملحوظ التشكل القحفي. هذا الأسلوب يسهل كثيرا من التحقيق في تنظيم الجزيئية والخلوية من نمط أنواع محددة في مجمع القحفي. تجارب في السمان والبط الأجنة خيالية وقد كشفت بالفعل العصبية التفاعلات الأنسجة بوساطة قمة والسلوكيات خلية مستقلة التي تنظم نمط أنواع محددة في الهيكل العظمي القحفي، الجهاز العضلي، وإهاب. التنوع الكبير في المشتقات قمة العصبية تقترح إمكانية كبيرةللتطبيقات المستقبلية لنظام خيالية السمان بطة لفهم تطور الفقاريات، والمرض، والتطور.
الهيكل العظمي الوجه يتطور من النمو واندماج العمليات الوجه المتعددة التي تتكون من قمة العصبية وأرومية متوسطة اللحمة المتوسطة محاطة الأدمة والطبقات الظهارية الأديم الباطن 1-11. تخضع الأحداث التخلق في كل عملية من قبل التفاعلات إشارات متميزة بين اللحمة المتوسطة وظهائر المحيطة 12-16. تعديلات على هذه التفاعلات إشارة و / أو المستجيبات المصب على المساهمة في الظواهر والأمراض قد تكون ذات صلة أيضا تطور الهيكل العظمي القحفي 17، 18. لذلك، توضيح توقيت وطبيعة التفاعلات الأنسجة لديها امكانات كبيرة لزيادة فهمنا للبيولوجيا التطورية والتنموية من الهيكل العظمي في الوجه.
استخدام الأجنة خيالية للتحقيق في التفاعلات الأنسجة لديها تاريخ طويل في البيولوجيا التطورية. كان رائدا هذا النهج هانز سبيمان ومختبرهالذي اكتشف الجنينية "المنظمين" عن طريق زرع أنسجة الأجنة بين الأنواع البرمائية مختلفة. كان سبيمان على درجة الماجستير من التقنيات الجراحية الدقيقة التي تم استكمالها تطوره من الأدوات المتخصصة، ولا سيما ماصة سبيمان مهارات اليد. وكان فيكتور همبرغر وهو طالب دراسات عليا في مختبر هانز سبيمان في فرايبورغ خلال 1920s، وهو عندما أجريت التجارب زرع الأصلية التي أدت إلى جائزة نوبل سبيمان. عندما انتقلت همبرغر لجامعة واشنطن في سانت لويس في عام 1935، وقال انه مفصل عملية صنع micropipette سبيمان في دليل له من علم الأجنة التجريبية 19. كان درو Noden وهو طالب دراسات عليا في مختبر همبرغر في جامعة واشنطن حتى عام 1972، وبعد انتقاله إلى جامعة ماساشوستس، أمهرست ثم إلى جامعة كورنيل، واصلت Noden افتعال وباستخدام بال micropipettes سبيمان لزرع الجراحية التي تنطوي الوهم السمان-الفرخ. و# 160؛ في حين طالب دراسات عليا، واحدة من الكتاب (ريتش شنايدر) تدرب مع درو Noden في جامعة كورنيل 1995-1998 ويستند البروتوكول التالي لصنع micropipette سبيمان على أوصاف مكتوبة من قبل همبرغر وNoden، وتشمل التعديلات اللاحقة التي بواسطة شنايدر.
كان رائدا في استخدام الوهم السمان-الفرخ لدراسة تطوير القحفي وخصوصا لفهم المساهمات من الخلايا العصبية التي كتبها قمة Noden ولو Douarin في أوائل 1970s، استعرض في لو Douarin وآخرون 20. وقد اعتمد هذا النهج على نطاق واسع في العديد من الدراسات والعديد من المحققين الآخرين 1، 4، 5، 21-38. معدلات يعادل النمو والتشكل من السمان وفرخ جعل زرع داخل يجعلها مثالية لدراسة مصير الخلايا وتتبع النسب. ومع ذلك، ونظرا للتشابه بين السمان وفرخ، والتغيرات المورفولوجية دائرة الهجرة والجنسيةuced بواسطة الخلايا المانحة يصعب فك. في المقابل، وشملت غيرها من نظم خيالية الطيور البط المحلية باعتبارها وسيلة لدراسة الآليات التي تجعل الأجنة متميزة تشريحيا 39-50. وبشكل أكثر تحديدا، فإن النظام خيالية السمان بطة يقدم فوائد متعددة لالمميزين آثار المانحة على المضيف، والعكس بالعكس. الأولى، والسمان والبط الأجنة تختلف في حجم الجسم والشكل، والذي يوفر وسيلة مباشرة لاستكشاف أو المانحين آليات المضيف محددة من تشكيل نمط من قبل يعاير للنطاقات الفرق في التعبير الجيني (الشكلان 1 A و B). الثانية، والسمان والبط الأجنة لديهم معدلات مختلفة إلى حد كبير من النضج، مع السمان تفقيس في 17 يوما والبط تفقيس في 28 يوما. يحافظ على قمة العصبية المزروعة معدل نضوج الجوهرية في إطار البيئة المضيفة، وبالتالي، تحديد التغيرات الزمانية في التعبير الجيني، والتفاعلات الأنسجة، وتكون الأنسجة، والتشكل من الممكن51-57. وأخيرا، فإن الأجسام المضادة النووية المضادة للالسمان (س ¢ PN) يسمح المانحة والمضيفة المساهمات الخلوية لتكون متميزة عن بعضها البعض بشكل دائم من خلال الاعتراف البروتين الذي يتم التعبير بتواجد مطلق في خلايا السمان ولكن غاب عن خلايا بطة.
قمة العصبية هي الخلايا الجنينية السكان عابرة أن يهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ويفرق في أنواع الخلايا المتنوعة، بما في ذلك غضروفية وبانيات، التي تسهم في الهيكل العظمي القحفي. وقد ساهم زرع قمة العصبية في النظام خيالية السمان البطة إلى حد كبير في فهمنا للتفاعلات الأنسجة ومسارات الإشارات التي تنظم تطوير الهيكل العظمي القحفي. ومع ذلك، وبالنظر إلى الإمكانات الهائلة للقمة العصبية لتوليد خلايا العضلات الملساء أيضا، الخلايا الشحمية، الخلايا الصباغية، وخلايا شوان، والخلايا العصبية، ونظام الوهم السمان بطة لديها امكانات هائلة لتطبيقات المستقبل، لا سيما بالتزامن مع التقدم السريع في بيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي. منذ السمان والبط وكلاهما الأنواع المرباة تجاريا، وإمدادات جاهزة من البويضات المخصبة غير مكلفة نسبيا هو متاح من مجموعة متنوعة من المزارع. وبالتالي، ينبغي أن تكون هذه التقنية في متناول الأبحاث وراتبها العاملة ضمن مجموعة واسعة من الميزانيات ومساحة المنشأة.
على الرغم من أن هذه التقنية هي قوية جدا، لا تزال هناك العديد من القيود. مثل تقنيات جراحية أخرى، ونوعية وجدوى الوهم السمان بطة الاعتماد على المهارات الجراحية للباحث، وبالتالي، لن يكون هناك اختلاف بين أكثر وداخل الفرد بين التجارب بالمقارنة مع نماذج أخرى، مثل تلك التي تستخدم الماوس علم الوراثة. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا تباين في معدلات التنمية ومراحل الأجنة الفردية التي تسهم في استنساخ ونجاح كل زرع. أجنة الطيور هي أيضا عرضة للجفاف وبالتالي تشمل الخطوات الحاسمة أثناء الجراحة الحفاظ على مستويات الضوء المنخفضة، وهي المرة تحت المجهر إلى أدنى حد ممكن، والبيض مختومة بالشمع قدر الإمكان، وارتفاع نسبة الرطوبة في الحاضنة بعد الجراحة ل تجنب الجفاف.
من حيث الجدوى من الوهم، شيو sually بين 50-75٪ البقاء على قيد الحياة، على الرغم من هذه النسب يمكن أن تقلل من كبار السن في مرحلة جمع. في جلسة 4-6 ساعة نموذجية من الجراحة، يمكن للجراح من ذوي الخبرة تولد 10-15 الوهم. نجاح زرع يعتمد أيضا إلى حد كبير على نوعية الأدوات. أدوات جيدة تؤدي إلى أكثر اتساقا، والنتائج استنساخه. باستخدام الشعلة البروبان لجعل الإبر التنغستن يسمح الإبر الحادة للغاية في هذا الشأن. نوع الشعلة تستخدم لإحداث فرق كبير لأنه يتحكم في حجم اللهب. ويمكن أيضا أن تستخدم شحذ كهربائيا، ولكن هذا النهج لا يقترب حتى من إنتاج الإبر الحادة كما. استخدام قضبان التنغستن بدلا من الأسلاك المخزنة مؤقتا بحيث الإبر ويمكن إجراء على التوالي.
وmicropipette سبيمان، في حين تستغرق وقتا طويلا وصعبا لجعل، هو أداة مثالية لنقل الأنسجة. يمكن تخصيص ماصة مع فتحات مختلفة الحجم، ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا. وثمة عامل حاسم لالنقيبالجا سبيمان micropipette هو أن يكون بعض السوائل في ماصة قبل لمس طرف على سطح الجنين. وبعض من السائل تتدفق دائما عندما يتم الاتصال مع الغضروف المفصلي على الجنين. الضغط على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة السوائل والكسب غير المشروع يمكن إخراجه بدقة متناهية، في حين أن السماح بارتفاع طفيف على الحجاب الحاجز تمتص بلطف الكسب غير المشروع الأنسجة المانحة في ماصة. الحفاظ على القليل من الضغط الايجابي على الحجاب الحاجز تحافظ على الأنسجة الكسب غير المشروع المانحة في غيض من ماصة أثناء النقل، وضغط إضافية قليلة على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة المانحة الكسب غير المشروع لتوضع عمدا في البلد المضيف.
لحماية ماصة سبيمان أثناء التخزين والتعقيم، وإزالة لمبة من نهاية واسعة وبعناية إدراج غيض مدبب إلى لمبة. وضع ماصة سبيمان في أنبوب اختبار زجاجي، وتغطي الجزء العلوي مع رقائق الألومنيوم، والأوتوكلاف قبل الجراحة. بعد ماصات متعددة هي إعادةعدي المراد تعقيمها مرة أخرى لإجراء عملية جراحية، عكس الماصات، تسخين منهم تقريبا ليغلي في نفس الحل من الماء المقطر والمنظفات والأواني الزجاجية، ثم شطف مرارا مع الماء المقطر. ماصات الأوتوكلاف في أنابيب الفردية. يجب أن يتم استبدال أنابيب المطاط الذي يشكل الحجاب الحاجز وبعد عدة لمبة المطاط التعقيم أو عندما تصبح مظلمة وقاسية.
العديد من مكونات هذا البروتوكول تنطوي المعدات الخطرة. على سبيل المثال، فإن الإجراء لصنع سبيمان Micropipette ينطوي على ثلاثة أنواع من النيران وكذلك التدفئة، وسحب، وتهب، والانحناء، وقطع، وتلميع الزجاج. وبالتالي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE) أن يزيد من السلامة مثل نظارات واقية ومعطف المختبر أمر بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك، لأن الكثير من الناس يعانون من، أو لديها القدرة على تطوير والحساسية البيض، ودائما استخدام قفازات عند التعامل مع البيض. مع هذه الاحتياطات في الاعتبار، ونظام خيالية السمان بطة طسا طريقة آمنة وفعالة، ويمكن الوصول إليها نسبيا والتي لديها العديد من التطبيقات المستقبلية.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة (NIDCR) منحة F32 (DE021929) لJLF ومنحة DE016402 NIDCR R01 إلى RAS
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |