Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.
Zoogdieren falen in sensorische en motorische herstel na dwarslaesie door gebrek aan axonale hergroei onder het niveau van zowel de schade als een onvermogen om spinale neurogenese hervatten. Sommige anamniotes waaronder de zebravis Danio rerio vertonen zowel sensorische en functioneel herstel zelfs na volledige doorsnijding van het ruggenmerg. De volwassen zebravis is een gevestigde modelorganisme voor het bestuderen van regeneratie na dwarslaesie, met sensorische en motorische herstel van 6 weken na het letsel. Om te profiteren van in vivo analyse van het regeneratieve proces in de transparante larvale zebravis en genetische hulpmiddelen niet in de volwassen toegankelijke nemen, gebruiken we de larvale zebravis regeneratie studie na ruggenmerg doorsnijding. Hier laten we een methode voor het reproduceerbaar en verifieerbaar transecting het larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, uit onze gegevens blijkt zintuiglijke recovery begin op 2 dagen na het letsel (dpi), with de C-bocht beweging detecteerbaar met 3 dpi en hervatting van de gratis zwemmen met 5 dpi. Zo stellen wij de larvale zebravis als een metgezel instrument om de volwassen zebravissen voor de studie van herstel na dwarslaesie.
Belangrijke trauma aan het menselijke ruggenmerg resulteert vaak in permanente verlamming en gevoelsverlies onder het niveau van schade als gevolg van het onvermogen om axons teruggroeien of hervatten neurogenese 1,2. In tegenstelling tot zoogdieren, echter anamniotes waaronder salamanders en zebravis (Danio rerio) tonen krachtig herstel, zelfs na volledige ruggenmerg doorsnijding 3,4.
De volwassen zebravis is een goed uitgewerkt model voor het bestuderen van het herstelproces na dwarslaesie 5-7. Na volledige ruggenmerg doorsnijding, is herstel van sensorische en locomotief functie waargenomen in de volwassen zebravissen met 6 weken na het letsel 8. Om het regeneratieve proces in vivo onderzoeken we kwamen de transparante larvale zebravis 9.
Hier presenteren we een methode om het ruggenmerg van een 5 dagen na de bevruchting (DPF) larvale zebravis usi doorsnijdenng een afgeschuinde micro-injectie pipet als een scalpel, gewijzigd van Bhatt, et al.. 10 Deze methode ondersteunt high throughput, lage sterfte en reproduceerbaarheid. Met de praktijk, kan 300 larven / uur worden doorsneden, en meer dan 6 maanden van doorsnijdingen, waaronder meer dan 3600 dieren, 98.75% ± 0,72% overleefde tot 7 dagen na het letsel (dpi). Onze gegevens blijkt snel herstel van de sensorische en motoriek ook: op 1 dpi, wordt alle verkeer door de gewonde vis gedreven door slechts borstvin motoriek. Echter, larven beginnen te reageren op de naald contact caudaal wolfraam te doorsnijden met 2 dpi, herstel de C-bocht beweging door 3 dpi, en weer roofzuchtige zwemmen met 5 dpi 11. Met behulp antilichaamkleuring tegen geacetyleerd tubuline, hebben we bevestigd dat axonen afwezig zijn van het letsel site op 1 dpi, maar het letsel website hebben doorkruist door 5 dpi. Wij geloven dat dit protocol een waardevolle methode voor de studie van axonale hergroei en neurogenese in het ruggenmerg na verwonding. </p>
Bij de eerste leren van deze techniek, raden we proberen niet meer dan 50-100 doorsnijdingen in een enkele sessie. Na het beheersen van deze techniek zijn we in staat om het doornemen tot 300 embryo's per uur; echter, dit niveau van throughput vereist een paar maanden van wekelijkse praktijk. We raden ook aan het oefenen met een verslaggever lijn en verifiëren volledige doorsnijding tot de incidentie van onvolledige ruggenmerg doorsnijding wordt teruggebracht tot minder dan 1%.
Ruggenme…
The authors have nothing to disclose.
We zijn dank verschuldigd aan de Universiteit van Utah zebravis faciliteit voor veeteelt. RID werd ondersteund door NIH R56NS053897 en LKB was een predoctorale opleiding wordt ondersteund door de HHMI Med-Into-Grad initiatief.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
microgrinder | Narishige | EG-44 | |
Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
1ml syringe | BD | 309625 | |
27 ga. needle | BD | 305109 | |
Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
20x E2 (1L) | store at RT | ||
17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
1x E2 (1L) | store at RT | ||
50ml 20x E2 | |||
2ml fresh 500x NaCO3 |