Descreve-se um método para a indução de inflamação pulmonar neutrofílica desafio por aerossol para lipopolissacarídeo por nebulização, para modelar a lesão pulmonar aguda. Além disso, também são descritas as técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavado bronco-alveolar.
A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma doença grave, caracterizada por neutrofilia alveolar, com opções limitadas de tratamento e alta mortalidade. Modelos experimentais de ALI são fundamentais para melhorar a nossa compreensão da patogênese da doença. O lipopolissacárido (LPS) derivadas a partir de bactérias gram positivas induz inflamação neutrofílica nas vias aéreas e do parênquima pulmonar de ratos. Administração pulmonar eficaz de compostos, tais como LPS é, no entanto, difícil de alcançar. Na abordagem aqui descrita, a administração pulmonar em ratinhos é obtido por desafio com aerossol Pseudomonas aeruginosa LPS. LPS foi dissolvido em aerossol através de um nebulizador conectado ao ar comprimido. Os ratinhos foram expostos a um fluxo contínuo de aerossol de LPS numa caixa de plexiglas durante 10 minutos, seguido de 2 minutos após o condicionamento de aerossol foi descontinuado. Entubação traqueal e subsequente lavagem broncoalveolar, seguido por perfusão de formalina foi realizada próximo, o que permite a caracterização do p estérilinflamação ulmonar. Aerosolized LPS gera uma inflamação pulmonar caracterizada por neutrofilia alveolar, detectado no lavado bronco-alveolar e pela avaliação histológica. Esta técnica pode ser configurado com um custo pequeno, com poucos aparelhos, e exige treinamento e experiência mínima. O sistema de exposição pode, portanto, ser realizado rotineiramente em qualquer laboratório, com o potencial de melhorar a nossa compreensão da patologia pulmonar.
O lipopolissacárido (LPS) é um componente da parede celular de bactérias gram-negativas 1. Desafio ao LPS é um modelo bem documentado da lesão pulmonar aguda, uma síndroma caracterizada por inflamação e edema agudo neutrofílica 2. Além disso, a neutrofilia pulmonar é também uma característica da doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) 3, e provocação com LPS em seres humanos tem sido utilizado para modelar as exacerbações da DPOC 4. Assim, modelos experimentais de exposição LPS são clinicamente relevantes e ferramentas valiosas para entender a patologia humana.
O objetivo da administração pulmonar de LPS aerossol descritas aqui é gerar uma resposta inflamatória neutrofílica na condução e vias respiratórias, sem envolvimento sistêmico. Várias técnicas de provocação com LPS foram descritos anteriormente. Injecção intra-venosa do LPS é a via de administração mais utilizada. Embora esta técnica é facilmente acessível, tele dano primário é para o endotélio, com destruição secundário do epitélio pulmonar após a migração de neutrófilos para o pulmão. A administração intra-venosa também induz inflamação sistémica 2, o que pode complicar o quadro clínico em modelos animais. Inflamação sistémica está em contraste não observados com a administração intra-traqueal. Esta técnica, no entanto, é trabalhoso e requer anestésicos, bem como treinamento considerável 5, 6. Além disso, a deposição pulmonar por esta via de administração é dependente de respiração 7. Assim, a deposição pulmonar é afectada pela profundidade da anestesia necessários para a administração intra traqueal e variável deposição nas vias aéreas pode ser observada. Em contraste, a administração pulmonar com LPS requer o mínimo de formação de aerossol, e pode ser facilmente conseguido com um grande número de animais com pouca ou nenhuma variação entre indivíduos 5, 8.Um estudo recente confirmou que o fornecimento de aerossol é superior a via intra-traqueal em relação à deposição, e que doses mais pertinentes do LPS induzir inflamação neutrofílica com este modelo 8.
Estudos anteriores demonstraram que a desafio aerossolizado Psuedomonas aeruginosa LPS gera uma resposta inflamatória significativa no lúmen das vias aéreas e do parênquima pulmonar, incluindo os espaços alveolares 9, 10. A inflamação é caracterizada pela predominância de neutrófilos e presença de edema pulmonar, e pode, assim, ser usado para endereçar patogénese da lesão pulmonar aguda e ganhar conhecimento adicional sobre os mecanismos que contribuem para a patologia da doença.
Em aerossol de LPS gera uma resposta inflamatória nas vias aéreas, caracterizada por neutrófilos na submucosa epitelial, espaços circundantes as vias aéreas de condução, bem como os espaços alveolares. Isto é, em conjunto com o aumento do conteúdo de proteína total na LBA, indicativo de perda de plasma, representativo da patologia da lesão pulmonar aguda. Como LPS induz uma inflamação estéril, a reacção é independente da resposta imune adaptativa, e existem limitações para a relevância para infecç?…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Suécia), Benita Dahlberg e Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, em Estocolmo, Suécia), bem como Dr. Martin Stampfli (Universidade McMaster, Hamilton, ON, Canadá) para obter assistência hábil e conselhos de especialistas.
Name of the material/equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
Purified Pseudomonas aeruginosa LPS | Sigma-Aldrich | Harmful. Recomended purification. LPS purified from other bactria may be used. | |
Pari LC sprint star nebulizer | PARI Respiratory Equipment Inc. | 023G1250 | |
TSI mass flowmeter 4040 | TSI | 4040 | Alternative product from supplier may be used. |
Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube | Sigma-Aldrich | Z685704 | Recomended brand. |
Plexiglas boxes with removable lids | Custom built | N/A | 150 x 163 x 205 mm (a 2 mm hole on the side). |
3M Half Facepiece Reusable Respirator | 3M | 7503 | Recomended brand. |
3M Advanced Particulate Filters (P100) | 3M | 2291 | Recomended brand. |
Sissors | VWR | 233-1104 | Preferred scissors may be used. |
Forceps | VWR | 232-1313 | Preferred forceps may be used. |
Intramedic PE50 polyethylene tube | BD | 427411 | Recomended brand. |
Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread | VWR | 95056-992 | Recomended brand. |
26 ½ gage needle | Alternative suppliers exist. | ||
1 mL BD slip-tip syringe, non-sterile | BD | 301025 | Alternative suppliers exist. |
60 mL BD Luer-Lok syringe, non-sterile, polypropolene | BD | 301035 | Alternative suppliers exist. |
Fluka Hematoxylin-Eosin | Sigma-Aldrich | 3972 | Alternative suppliers exist. |
Türk's solution | Merck Millipore | 109277 | |
Table top centrifuge | Alternative manufacturers exist. | ||
Cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | Alternative centrifuge can be used. |
HEMA-3 stat pack | Fisher Scientific | 23-123-869 | Alternative staining kits exists. |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Alternative suppliers exist. |