In vitro methode om E-selectine-gemedieerde interacties tussen Prostaat circulerende tumorcellen afkomstig van patiënten en humane endotheelcellen Observeer
Summary
Ons verslag beschrijft een unieke methode om te visualiseren en te analyseren CTC / EG interacties bij prostaatkanker onder fysiologische stromingscondities.
Abstract
Metastase is een proces waarin tumorcellen werpen uit de primaire tumor intravasate bloedvatensysteem en lymfestelsel daardoor toegang tot extravasatie en vormen een secundaire niche. De extravasatie van tumorcellen uit het bloedvatensysteem kan worden bestudeerd door endotheelcellen (EC) en tumorcellen verkregen uit verschillende cellijnen. Initiële studies werden uitgevoerd met statische omstandigheden, maar het is goed gedocumenteerd dat EC zich anders gedragen onder fysiologische stroomomstandigheden. Daarom worden verschillende samenstellingen stroom kamer momenteel gebruikt voor het bestuderen kankercel interacties met EC. Huidige stromingskamer assemblages bieden reproduceerbare resultaten met behulp van verschillende cellijnen of vloeistof op verschillende shear stress omstandigheden. Echter, te observeren en te bestuderen interacties met zeldzame cellen, zoals circulerende tumorcellen (CTCs), bepaalde wijzigingen moeten worden aangebracht in de conventionele stroom kamer samenstel. CTCeen zeldzame celpopulatie tussen miljoenen bloedcellen. Bijgevolg is het moeilijk om een zuivere populatie van CTCs vinden. Verontreiniging van CTCs met verschillende soorten cellen die normaal in de circulatie onvermijdelijk middels onderhavige verrijking of depletie technieken. In dit rapport beschrijven we een unieke methode om fluorescent label circulerende prostaatkankercellen en studie van hun interactie met EC in een zelf-geassembleerde stromingskamer systeem. Deze techniek kan verder worden toegepast op interacties tussen prostaat CTCs en een eiwit van belang in acht.
Introduction
Metastase is een complexe multi-step proces dat nog slecht begrepen. De E-selectin/selectin ligand as is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen bij tumor metastase bevorderen primaire bindingsinteracties tussen het vasculaire endotheel en kankercellen 1,2. Endotheliale (E)-selectine is een transmembraan eiwit door geactiveerde endotheelcellen tot expressie, terwijl de andere E-selectine ligand (en) tot expressie door tumorcellen 3. Talloze in vitro benaderingen succes toegepast model E-selectin/selectin ligand interacties tussen tumorcellen en endotheelcellen (EC) 1. Om deze interacties te bestuderen worden verschillende stromingskamer systemen worden gebruikt voor het simuleren van bloed vaatstelsel. Onder stroom kamer samenstellen wordt parallelle plaat stroming kamer (PPFC) in combinatie met EC routinematig gebruikt als een in vitro model simuleert in vivo shear stress omstandigheden. In dezemethode, EC's worden gekweekt op een 35-mm schotel en na het bereiken van een monolaag, worden EC's verbonden aan de PPFC en shear stress gebaseerde experimenten worden uitgevoerd.
Echter, PPFC en andere huidige systemen presenteren veel beperkingen aan het bestuderen lijm interacties tussen circulerende tumorcellen (CTC's) afkomstig van patiënten en EC, vooral omdat CTC zijn een zeldzame populatie van cellen, vergoten is van de primaire tumor, circuleren onder de miljoenen bloedcellen (1 CTC per 10 9 bloedcellen) 4. Vandaar dat, in tegenstelling tot onbeperkt aanbod van gekweekte cellijnen, laag CTC tellingen leiden tot zeer weinig en zeldzame CTC / EG interacties, die een goede doorstroming kanaalbreedte om de interacties voor het afspelen analyse op te nemen. Bovendien, aangezien de patiënt afgeleid CTC zijn een onzuivere bevolking, dus een identificatie marker is vereist om CTC's volgen in het bijzonder. Om dit probleem op te lossen, een nieuwe methode om prostaatkanker te identificeren (PCA) CT ontwikkelden weCs door te profiteren van het feit dat vrijwel al deze CTCs expressie prostaat-specifiek membraan antigeen (PSMA) op hun celoppervlak 5,6. In dit rapport, gebruikten we de prostaatkanker cellijn, MDA PCa2b (MDA), om het potentieel nut van ons nieuwe systeem aan prostate CTC interacties te bestuderen met EC's te tonen, uiteindelijk tot het mechanisme van metastase begrijpen.
De methodologie kan worden toegepast voor verschillende shear gebaseerde experimenten gesimuleerd in vivo vasculaire systeem 7-9. Naast onderzoeken PCa CTC / EG interacties kan de stroom kamer systeem eenvoudig worden aangepast voor het analyseren van perifeer bloed mononucleaire cellen of interacties tumorcellen met EC. Het gemak van het demonteren en monteren van de stroom kamer, een microglaasje III (0.1) (hierna aangeduid als microglaasje), laat kweken EC onder perfusie en het stimuleren van EC met verschillende cytokinen aan pr te inducerenotein expressie. Daarnaast gekweekte EC, recombinante eiwitten zoals E-en P-selectine worden aangebracht op het microscoopglaasje en interacties met tumorcellen kan worden waargenomen onder laminaire stroomomstandigheden 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege het lage aantal CTCs tussen bloedcellen, is het moeilijk om CTCs isoleren als een zuivere populatie cellen. Om CTC / EG interacties te bestuderen, de zeldzame en onzuivere bevolking van CTC brengt twee grote uitdagingen: a) identificatie van CTCs onder bloedcellen; b) Waarneming van CTC / EG interacties.
De eerste beperking identificeren prostate CTCs tussen bloedcellen overwinnen, hebben we gebruik van het feit dat vrijwel alle prostaat tumorcellen PSMA <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van het Ministerie van Defensie-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 van het National Cancer Institute, en de Robert McCooey Genitourinary Fonds voor Onderzoek van de Oncologie. We willen graag Dr Annarita Lorenzo (Afdeling Pathologie) bedanken voor VE-cadherine antilichamen, en dr. Marco Seandel (Afdeling Heelkunde) voor het verstrekken van HUVECs.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
