Summary

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Published: May 12, 2014
doi:

Summary

استهداف الخلايا المقيمين في الدماغ لإعادة برمجة المباشر النسب-يقدم آفاقا جديدة للإصلاح الدماغ. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إعداد الثقافات المخصب لpericytes المقيمين في الدماغ من الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل هذه الخلايا العصبية إلى الناجمة عن الفيروس الارتجاعي بوساطة تعبير عن عوامل النسخ Sox2 وAscl1.

Abstract

مباشر النسب-إعادة برمجة الخلايا غير العصبية إلى الخلايا العصبية التي يسببها (INS) قد توفر نظرة ثاقبة لآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الخلايا العصبية وتمكين استراتيجيات جديدة لنمذجة في المختبر أو إصلاح الدماغ المريضة. تحديد أنواع الخلايا غير العصبية المقيمين في الدماغ قابلة للتحويل المباشر في دائرة الهجرة والتجنيس قد تسمح لإطلاق مثل هذا النهج في الموقع، أي داخل أنسجة المخ التالفة. نحن هنا وصف بروتوكول وضعت في محاولة لتحديد الخلايا المشتقة من الدماغ البشري الكبار التي تلبي هذه الفرضية. هذا البروتوكول ينطوي على: (1) زراعة الخلايا البشرية من القشرة المخية التي تم الحصول عليها من الخزعات الدماغ البشري الكبار؛ (2) التوسع في المختبر (التي تتطلب حوالي 2-4 أسابيع) وتوصيف الثقافة التي كتبها كيمياء سيتولوجية مناعية والتدفق الخلوي؛ (3) إثراء من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) استخدام الألغام المضادة للPDGF مستقبلات β والأجسام المضادة للCD146؛(4) تنبيغ بوساطة الارتجاعي مع النسخ العصبية عوامل sox2 وascl1؛ (5) وأخيرا توصيف الخلايا العصبية الناتجة المشتقة من خلية حوطية يسببها (PdiNs) من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية (14 يوما إلى 8 أسابيع بعد تنبيغ فيروسات). في هذه المرحلة، يمكن أن دائرة الهجرة والتجنيس سيتم بحثها لخصائصها الكهربائية عن طريق تسجيل التصحيح، المشبك. يوفر هذا البروتوكول إجراء تكرار للغاية لفي المختبر النسب تحويل pericytes المقيمين في الدماغ الإضافية الإنسان الوظيفية.

Introduction

بدلا من إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، والتي بدورها وهبوا مع مجموعة كبيرة من إمكانات التمايز، وتهدف إعادة برمجة المباشر للتحويل مباشرة من نوع واحد خلية معينة إلى أخرى. فيما يتعلق تطبيقها في سياق النمذجة المرض والعلاجات المستندة إلى الخلايا المحتملة، كلا النهجين إعادة برمجة لديها مزايا وعيوب محددة. إعادة برمجة في iPSCs (ط) يوفر مصدرا غير محدود تقريبا من الخلايا؛ (ب) يسمح للهندسة الوراثية؛ (ج) يمنح مع احتمال التمايز غير محدودة تقريبا. ومع ذلك، العيوب الرئيسية لiPSCs تنطوي على خطر tumorigenicity من خلايا غير متمايزة (تشكيل مسخي في الجسم الحي) والحاجة إلى فيفو السابقين زراعة وزرع اللاحقة إذا كانت هذه الخلايا هي لاستخدامها في العلاجات المستندة إلى الخلايا. على العكس، يقتصر المباشر النسب-إعادة برمجة من العائد أقل من الخلايا المطلوبوالذي يرتبط مباشرة مع عدد من الخلايا المستهدفة من السكان بدءا، ولكن تمتلك ميزة أن تظهر الخلايا التي أعيدت برمجتها النسب لعرض أي خطر على مكون للأورام زرع 1،2؛ علاوة على ذلك، يمكن حتى يتحقق إعادة برمجة مباشرة في الموقع، أي داخل الجهاز حيث ستلزم هذه الخلايا، وبالتالي تجنب الحاجة إلى الزرع.

مع هذا في الاعتبار، مختبرنا اتبعت إمكانية خلايا الدماغ مقيم إعادة برمجة النسب في دائرة الهجرة والتجنيس كما نهجا جديدا نحو العلاجات المستندة إلى الخلايا من أمراض الاعصاب. تتكون خلايا الدماغ المقيمين التي قد يحتمل اعتباره أهداف الخلوية لإعادة برمجة النسب-أنواع مختلفة من الدبق الكبروي (الخلايا النجمية، وخلايا NG2 و oligodendrocytes)، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا المرتبطة microvessel (الخلايا البطانية وpericytes). درسنا على نطاق واسع لإعادة برمجة المحتملة في المختبر من دبق نجمي الخلايا الدماغية من مجلس النوابتكس في وقت مبكر بعد الولادة الفئران 3-5. بحثا عن مصادر خلية مناسبة مماثلة لمباشرة النسب-إعادة برمجة الدماغ في الإنسان البالغ، ونحن اجه السكان الخلية التي يمكن برمجتها بنجاح في دائرة الهجرة والتجنيس والدمغات المعرض من pericytes. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية جني هذه الخلايا من الخزعات الدماغ البشري الكبار، لتوسيع وإثراء هذه الخلايا في المختبر، وأخيرا إعادة برمجة بنجاح جزء كبير من هذه الخلايا في المختبر الموسعة (في حدود 25-30٪) في دائرة الهجرة والتجنيس. لا يمكن أن يتحقق عن طريق إعادة برمجة وقت واحد بوساطة الارتجاعي شارك في التعبير عن اثنين من عوامل النسخ، sox2 وascl1. تم العثور على هذه PdiNs لاكتساب قدرة العمل المتكررة إطلاق إمكانات لخدمة أهداف ومتشابك أما الخلايا العصبية الأخرى مما يدل قدرتها على الاندماج في الشبكات العصبية. يوفر بروتوكول لدينا إجراءات واضحة لعزل ونسب التحويل من pericytes الدماغ البشري الكبار في دائرة الهجرة والتجنيس. </ع>

Protocol

1. عزل والتثقيف من خلايا الدماغ البشري الكبار يجب أن يتم تنفيذ التجارب التي تنطوي على الأنسجة البشرية وفقا لجميع الأنظمة الحكومية والمؤسسية ذات الصلة فيما يتعلق باستخدام المواد البشرية لأغراض البحث. وقد تم تطوير هذا البروتوكول وف…

Representative Results

والنتيجة الأولى لهذا البروتوكول بعد بنجاح إرساء ثقافة من عينة من الكبار الإنسان قشرة الدماغ يتكون في تحديد تركيبة الخلوية للثقافة. كيمياء سيتولوجية مناعية لبروتينات معينة نوع من الخلايا يكشف عن درجة كبيرة من التجانس بين الثقافات المستمدة من عينة من المرضى مختلفة <st…

Discussion

يصف هذا البروتوكول التوسع في المختبر وإثراء الخلايا المشتقة من خلية حوطية التالية بمعزل عن الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل اللاحقة في دائرة الهجرة والتجنيس من قبل بوساطة التعبير الارتجاعي من النسخ العصبية عوامل Sox2 وAscl1. يوفر هذا البروتوكول تجريبية في نظا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن ممتنون للدكتور ماغدالينا غوتس لإدخال لها خلال تطوير هذا البروتوكول. نشكر الدكتور ماريوس Wernig (جامعة ستانفورد) لتزويدنا بسخاء مع تسلسل sox2 الترميز. ونحن أيضا ممتنون جدا للدكتور الكسندرا Lepier لإنتاج الفيروس. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من تلقى الفنون إلى MK [بكس] وبتمويل من SYSTHER-ثنائية القومية جمعية الألمانية للبحوث (BE 4182/2-2) وBMBF (01GN1009A) إلى BB، وزارة ولاية بافاريا للعلوم والبحوث و INREMOS المعهد الافتراضي (الألمانية والسلوفينية الوزارات الاتحادية للتعليم والبحوث) وDFG (SFB 824).

Materials

anti-CD140b-PE BD Biosciences 558821 use 1:100
anti-CD146-FITC AbD Serotec MCA2141FT use 1:100
anti-CD13-FITC AbD Serotec MVA1270A488T use 1:100
anti-CD34-APC BD Biosciences 560940 use 1:100
anti-PDGFRβ Cell Signaling 3169S use 1:200
anti-CD146 Abcam Ab75769 use 1:400
anti-NG2 Millipore AB5320 use 1:400
anti-SMA Sigma-Aldrich A2547 use 1:400
anti-βIII-tubulin Sigma-Aldrich T8660 use 1:400
anti-MAP2 Sigma-Aldrich M4403 use 1:200
anti-GFAP Sigma-Aldrich G3893 use 1:600
anti-GFP Aves Labs GFP 10-20 use 1:1000
anti-RFP Chromotek 5F8 use 1:500
anti-S100β Sigma-Aldrich S2532 use 1:300
anti-NeuN Millipore MAB377 use 1:200
anti-GABA Sigma-Aldrich A2052 use 1:500
anti-Calretinin Millipore AB5054 use 1:500
anti-vGluT1 SYnaptic SYstems 135511 use 1:1000
Rat IgG1 isotype control FITC AbD Serotec 11-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control PE AbD Serotec 12-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control APC AbD Serotec 17-4301-81 use 1:100
TrypLE Invitrogen 12605-010
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504044
fetal calf serum Invitrogen 10106-169 perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Invitrogen 24020-091
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) Invitrogen 14190
HEPES  Sigma-Aldrich H3375
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P0899
PFA (paraformaldehyde) Sigma-Aldrich P1648
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate Sigma-Aldrich 042M4005
Aqua-Poly/Mount Polysciences 18606-20
Polypropylene round-bottom tubes  BD Biosciences 352063
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
24-well plates Orange Scientific 5530305
75 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 658175
25 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 690175
Disposable pipettes 10 ml Sarstedt #########
Glass Pasteur pipettes (150 mm) Fisherbrand FB50251
Glass coverslips 12 mm diameter Menzel CB00120RA1
Surgical disposable scalpels  B. Braun 5518083
Tissue culture dishes  Greiner Bio-One 633180
Conical tubes 15ml BD Biosciences 352095
Laminar flow hood
Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes Hettich Lab Technology 1406
Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software  BD Biosciences
Humified cell culture incubator Eppendorf Galaxy 170R
Wather bath at 37 °C
FACSFlow sheath fluid  BD Biosciences 342003
Epifluorescence microscope BX61 Olympus
Confocal microscope LSM710 Zeiss

References

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).

Play Video

Cite This Article
Karow, M., Schichor, C., Beckervordersandforth, R., Berninger, B. Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons. J. Vis. Exp. (87), e51433, doi:10.3791/51433 (2014).

View Video