Многокомпонентные белковые комплексы играют важнейшую роль в процессе клеточного функции и развития. Здесь мы описываем способ, используемый для изоляции нативные белковые комплексы из эмбрионов Drosophila после сшивания в естественных условиях с последующей очисткой сшитых комплексов для последующего анализа структуры и функции.
Многие клеточные процессы управляются мультисубъединичных белковых комплексов. Часто эти комплексы образуют временно и требуют родную среду собираться. Поэтому идентифицировать эти функциональных белковых комплексов важно стабилизации им в естественных лизиса до и последующем очистки. Здесь мы опишем метод, используемый для выделения больших добросовестных белковые комплексы из эмбрионов дрозофилы. Этот метод основан на эмбриона проницаемости и стабилизации комплексов внутри эмбрионов в естественных условиях по сшивки с использованием низкую концентрацию формальдегида, который может легко через клеточную мембрану. Затем белковый комплекс, представляющий интерес, иммунологически последующей гелевой очисткой и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Проиллюстрируем этот метод, используя очистку белкового комплекса Tudor, что очень важно для развития зародышевой линии. Тудор большой белок, который содержит несколько доменов Тудор – маленькиймодулей, которые взаимодействуют с метилированных аргинина или лизина целевых белков. Этот способ может быть адаптирован для выделения нативных белковых комплексов из различных организмов и тканей.
Выделение мультисубъединичных белковых агрегатов и ДНК-или РНК-белковых комплексов выполняется для выявления белковых комплексов, геномной локусов признанный ДНК-связывающих регуляторных белков или РНК-мишеней РНК-связывающих белков. Различные методы позволяют генома выявления участков ДНК, признанных факторов транскрипции или белков хроматина (чип-SEQ) 1 и РНК-мишеней, связанных с данным РНК-связывающего белка (CLIP-след) 2. Библиотеки РНК, полученных кДНК или целей ДНК затем глубоко секвенировали. Эти методы используют химическую или ультрафиолетовым излучением сшивания для стабилизации комплексов с последующим иммунопреципитации (IP) с антителом против белкового компонента исследуемого комплекса.
Во время развития организма, многие белковые комплексы образуют временно. Поэтому, крайне важно проанализировать состав и функции этих комплексов в естественных условиях, чтобы понять молекулярные механизмы, которые управляют Development. Такой анализ в естественных условиях было бы лучше, экстракорпоральное подхода в так как практически невозможно воспроизвести родной концентрации взаимодействующих компонентов и сотовой биохимической среде в пробирке. Здесь мы продемонстрировать естественных условиях подход в том, что мы успешно использовать для изоляции больших белковых комплексов из эмбрионов дрозофилы. В этом способе белковые комплексы в живых эмбрионов сшиты с низкой концентрацией формальдегида и впоследствии белковые комплексы, представляющие интерес, выделяют IP с антителом против известного компонента комплексов с последующим очисткой на геле комплексов и масс-спектрометрического анализа в идентифицировать неизвестные сложные компоненты. Так как формальдегид способен проникать через клеточную мембрану и имеет сшивающий спектр 2,3-2,7 A 3, белковые комплексы могут быть сшиты в естественных условиях и сложные компоненты, вероятно, будут близки друг к другу. В этой статье мыописать этот метод, используя изоляцию Тудор (Tud) белкового комплекса в качестве примера. Tud является зародышевой линии белок, который имеет важное значение для развития зародышевой линии 4-7. Этот белок содержит 11 TUD домены известных взаимодействовать с метилированных аргинина или лизина других полипептидов 8-10.
Ранее мы сформировали трансгенного Drosophila линию, выражающую HA-меткой функциональная Tud 5 и поэтому, конкретных анти-HA антитела используется для снести TUD комплекс после сшивания.
В дополнение к белок-белковых сшивок, формальдегид может генерировать нуклеиновых кислот белковых сшивок и используется в чип-след экспериментов. Кроме того, у дрозофилы, в естественных условиях сшивания с формальдегидом позволило выявить РНК цели Васа РНК геликазы белка 11.
В то время как в этой статье мы опишем метод в естественных условиях сшивки и пурфикация белковых комплексов из эмбрионов Drosophila, этот метод может быть адаптирован для других организмов и тканей.
Формальдегид широко применяется в качестве сшивающего реагента для выявления белок-белковых взаимодействий и белок-нуклеиновая кислота. Его хорошую растворимость и проницаемость клеточной мембраны вместе с совместимостью с процедурами ниже по течению масс-спектрометрии, чтобы фор?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Иордания Дэвис, Яньнянь Лин, Эрик Schädler и Jimiao Чжэн за техническую помощь в этом исследовании. Эта работа была поддержана NSF КАРЬЕРА предоставить MCB-1054962 для ALA
Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |