Summary

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

Published: August 16, 2014
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Summary

Das Protokoll beschreibt die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt.

Abstract

Das Maushornhaut-Mikrotaschen-Assay ist ein robustes und quantitative in vivo-Test zur Bewertung der Angiogenese. Durch die Verwendung von standardisierten Slow-Release-Pellets, die bestimmte Wachstumsfaktoren, die Blutgefäßwachstum in der gesamten Hornhaut natürlich avaskuläre auslösen können Angiogenese gemessen und quantifiziert werden. In diesem Assay wird im Laufe von mehreren Tagen die angiogene Antwort erzeugt, abhängig von der Art und Dosis des Wachstumsfaktor verwendet wird. Die Induktion einer Neovaskularisation wird üblicherweise entweder durch basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) ausgelöst. Durch die Kombination dieser Wachstumsfaktoren mit Sucralfat und Hydron (Poly-HEMA (Poly (2-hydroxyethylmethacrylat))) und Gießen der Mischung zu Pellets, können sie operativ in der Maus Auge implantiert werden. Diese einheitlichen Pellets langsam lösen Sie die Wachstumsfaktoren über fünf oder sechs Tage (bFGF oder VEGF beziehungsweise) ermöglicht ausreichend angiogene Antwort für Gefäßfläche q erforderlichuantification mit der Spaltlampe. Dieser Test kann für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Bewertung von angiogenen Modulators Medikamente oder Behandlungen sowie Vergleich zwischen unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu beeinflussen Angiogenese verwendet werden. Ein erfahrener Ermittler nach dem Üben dieses Assays können ein Pellet in weniger als 5 min pro Auge zu implantieren.

Introduction

Der Prozess der Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße zu bilden, auffindbar sind, ist sehr komplex und wird durch verschiedene endogene Faktoren, die verschiedene Schritte des Schiffes Keimen und Morphogenese Steuerung geregelt. Angiogenese aufgrund einer Verschiebung im Gleichgewicht zwischen pro-und anti-angiogene Faktoren, die das Gleichgewicht hält normalerweise das Gefßsystem in einem Ruhezustand ausgelöst. Angiogenese beim Erwachsenen kommt in bestimmten physiologischen Bedingungen wie bei der weiblichen ovariellen Zyklus oder Reparaturprozessen wie der Wundheilung und Geweberegeneration. Es ist jedoch auch ein Markenzeichen von mehreren Krankheiten, einschließlich Malignitäten, Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen. Die Beteiligung von Angiogenese in diesen physiologischen und pathologischen Bedingungen ist es ein wichtiges Thema für Forschung und ein attraktives Ziel für die Therapie.

Aufgrund der Komplexität der Angiogenese und der Beteiligung mehrerer ceLLS und Faktoren in dem Verfahren, einschließlich Endothelzellen, Perizyten, zirkulierenden Zellen und Stromazellen in vitro-Modellen beschränkt bleiben und die einzigartige Mikroumgebung in vivo nicht zu wiederholen. Der Haupt in-vitro-Assays der Angiogenese sind weitgehend auf die Beobachtung direkte Auswirkungen auf Endothelzellen und Messen bestimmter Schritte in angiogenen Prozess unter kontrollierten Bedingungen konzentriert. Diese Assays umfassen die Quantifizierung der Endothelzellproliferation 1, Migration 2, Netzwerkbildung 3, 4 und Schlauchbildung Keime aus Sphäroiden. 5 Ex-vivo-Modellen, im Gegensatz zu den in vitro diejenigen, sind komplexer und enthalten mehrere Gewebezelltypen, wobei ein Beispiel die Aorten-Ring-Test 6. Dennoch, wie andere Systeme, kann es nicht den Beitrag von zirkulierenden Zellen und natürliche Stroma von Endothelzellen zu erfassen, wie in vivo existiert. VersucheAngiogenese unter Strömungs untersuchen, um die in vivo-Situation unter Verwendung mikrofluidischer Systeme 7 durchgeführt wird, aber auch diese Assays nachahmen, obwohl viel verbessert, sind noch nicht für alle in vivo vorhandenen Kammern entfallen.

Aufgrund der Einschränkungen der in vitro und ex vivo-Angiogenesemodellen in vivo Modellen bleibt das zuverlässigere Auswahl für Angiogenese-Studien. Beispiele für diese Modelle sind die Implantation von transparenten Kammern, "Fenster", die die Visualisierung von wachsenden Blutgefäße unter dem Mikroskop 8 zu ermöglichen, injizierbare subkutane Implantate wie Matrigel und Gefäßbildung in normalen Geweben wie Mausohr und dem Huhn Chorioallantoismembran (CAM ). Allerdings ist eine der akzeptablen und quantitative in vivo Angiogenese-Modellen die hier beschriebene Hornhautmikrotaschen-Assay Neovaskularisierung, welche das natürlich avaskulären nutztHornhaut als "Bildschirm" zu visualisieren und zu beurteilen, neue angiogene Wachstums 9.

Hier beschreiben wir die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt. Zunächst wurde das Modell verwendet werden, um unspezifische Reize angiogenen in Kaninchen-Hornhaut messen. Dies wurde durch die Einführung von Tumorstücke in das Kammerwasser von der Vorderkammer des Auges des Kaninchens durchgeführt und gemessen Tumor-induzierte Neovaskularisierung 11.

Allerdings wurde der Test später entwickelt, um Effekte von spezifischen Wachstumsfaktoren zu untersuchen 10, besser zu spezifizieren und zu standardisieren, die angiogene Wirkung. Um den Wachstumsfaktor in das Auge zu lösen, wurden Pellets mit langsamer Freisetzung, die bekannte Mengen von angiogenen Wachstumsfaktoren anstelle von Geweben verwendet. Die Verfügbarkeit von gereinigten rekombinanten Proteine ​​angiogenen wie bFGF oder VEGF aktiviert ihre Verwendung als spezifische Ziele der Angiogenese modulaters 12. Zunächst wurde der Assayweitgehend in Kaninchen, die einfacher, mit aufgrund ihrer Größe, aber später wurde das Modell in Mäuse setzten Werk verwendet werden; ein kleiner und kostengünstiger Tiermodell. Der Wechsel von Kaninchen, Mäuse vorgesehen einen wichtigen Vorteil in der Lage zu genetisch manipulierten Tieren zu verwenden, wodurch eine neue Ära der Erforschung der genetischen Komponenten beeinflussen die Angiogenese 13 entsteht. Neben der Nutzung von akzeptabler Hornhaut-Test bei der Untersuchung der Angiogenese, andere biologische Prozesse können ebenfalls unter Verwendung von modifizierten Assays untersucht. So wurden beispielsweise Studien von Lymphangiogenese möglich durch die Implantation von niedrig dosiertem bFGF-Pellets, die die Visualisierung von Lymphgefäßen durch spezifische molekulare Marker 14 erlaubt werden. Darüber hinaus hat dieser Test ein Mittel, um die Wirkung der Strahlung auf die Angiogenese zu bewerten 15 vorgesehen.

In Summe ist die Hornhaut-Mikro Angiogenese-Assay eine quantitative, reproducible, flexible Beurteilung der Angiogenese in vivo. Ein großer Vorteil dieses Tests besteht darin, dass die Messung der Hintergrundgefäße unnötig, weil die Behälter wachsen auf einem natürlich avaskulären Gewebe. Wir beschreiben hier das Protokoll dieses Tests in Details und verschiedenen Szenarien, die auftreten können, zu diskutieren. Der Test besteht aus 3 diskrete Segmente. Hier werden wir die Herstellung von Wachstumsfaktor-inclusive-Pellets, die spätere chirurgische Implantation und schließlich die Methode verwendet, um die daraus resultierenden neovaskulären Wachstum zu quantifizieren.

Protocol

Alle Protokolle mit Tieren sind, die von der Institutional Animal Care und Use Committee im Kinderkrankenhaus Boston vorgestellt und genehmigt und werden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labortierpflege (AAALAC) durchgeführt. Achten Sie darauf, sterile Instrumente und aseptischen techniqure verwenden, während der Durchführung des Verfahrens. 1. Herstellung der Pellets Wiegen Sie 10 mg von Sucralfat und 60 mg hydron…

Representative Results

Typische Ergebnisse für bFGF und VEGF-Pellets in den normalen niedrigen angiogenen C57BL / 6J Mäuse werden in 2A und B gezeigt. 2E zeigt die normale Verteilung der Gefäßfläche (VA) in der C57BL / 6J Belastung mit variierenden Dosen von diesen Wachstums Faktoren. 80 ng bFGF Pellets normalerweise in einer VA von etwa 2,0 mm 2 führen, wenn Werte in einem Bereich von 1,8 bis 2,4 mm 2 sind akzeptabel. 200 ng VEGF-Pellets führen typischerweise ein…

Discussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte bei der Durchführung einer erfolgreichen Hornhauttest. Die erste ist es, einheitliche Pellets geeignet ist, eingepflanzt und anregende Gefäße. Die wichtigsten Teile des Pelletzubereitung sind: 1) unter Verwendung von trägerfreien Wachstumsfaktor; 2) die Sicherstellung einer guten Mischung aus Wachstumsfaktor mit dem Sucralfat und hydron und 3), die sich die endgültige Mischung zügig, aber sorgfältig von der Eppendorf-Röhrchen auf das Netz, wo die Pellets gegossen werden. Es wird…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Kristin Johnson für die grafische Arbeit.

Materials

Section 1: Pellet preparation
Sucralfate Sigma #S0652
Hydron (aka Poly(2-Hema)) Sigma #P3932-10G
Ethanol Pharmco Products Inc #111000200CSGL
Growth factors: Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))
 Fibroblast growth factor (FGF) PeproTech #AF-100-18B
Vascular endothelial growth factor (VEGF) R & D Systems #293-VE-050/CF
35 mm dish Becton-Dickson #353001 Used for storage of pellets
10 cm petri dish VWR #25384-342 Used as work surface for preparing pellets
Mesh Sefar America #03–300/51 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave
Spatulas Fisher Scientific #21-401-10 Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific #05-408-146 One for hydron, one for sucralfate
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2315E Need 2 for pulling mesh apart
Centrifugal evaporator ThermoSavant DNA110 SpeedVac
Section 2: Surgical implantation of pellets
Operating microscope Zeiss
2.5% Avertin General anesthetic
Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% Falcon NDC# 6131401601 Eye anesthetic
Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment Bausch & Lomb NDC# 2420878055 Contains neomycin, polymixin and bacitracin
Ophthalmic microknife, 5 mm Surgistar #924501 30 degree angle
von Graef knife Ambler Surgical #3401E
Jewelers forceps, #1 Ambler Surgical #2301E Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye
Jewelers forceps, #5 Ambler Surgical #2305E For picking up pellets and placing on eye
Small curved scissors Ambler Surgical #5636E For trimming whiskers
Gauze For blotting eye after proparacaine
Section 3: Grading of Corneal Neovascularization
2.5% Avertin General anesthetic
Slit lamp Nikon FS-2 Needs an ocular with a reticule to assist in measuring

References

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Cite This Article
Birsner, A. E., Benny, O., D’Amato, R. J. The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (90), e51375, doi:10.3791/51375 (2014).

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