Dos fotones de imágenes, acoplado a nanodissection láser, son herramientas útiles para el estudio de los procesos degenerativos y regenerativos en el sistema nervioso central con resolución subcelular. Este protocolo muestra cómo etiquetar, imagen y diseccionar las fibras individuales de escalada en la corteza cerebelosa in vivo.
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Transección axonal que resulta de una lesión mecánica, agresión tóxica o las enfermedades neurodegenerativas es generalmente seguido por la degeneración de la parte distal del axón que se separa del cuerpo celular 10-13. Con unas pocas excepciones 2,7,14,15, axones dañados en el SNC de animales adultos son generalmente incapaces de activar un programa de recrecimiento 16.
Poco se sabe acerca de la dinámica en tiempo real de eventos degenerativos a nivel celular y subcelular. El desarrollo de nuevas estrategias para limitar el daño neuronal y promover el nuevo crecimiento neuronal requiere, como primer paso, aclarar el mecanismo por el cual las células neuronales singularmente lesionados degeneran y se regeneran. Este estudio se dirige más directamente mediante el control de la dinámica de una sola neurona in vivo. Mientras que las técnicas de imagen de fluorescencia de un fotón están limitados por una intensa dispersión de la luz visible, la excitación de dos fotones alcanza profundas capas corticales en lihe ratones con resolución subcelular 3,4,17. Tomando ventaja de los ratones transgénicos en los que las proteínas fluorescentes se expresan selectivamente en subpoblaciones de neuronas 18-20, microscopía de TPF ha sido aplicada a la exploración de la plasticidad sináptica y la elongación axonal durante el desarrollo in vivo 21,22. L a la capacidad de las neuronas dañadas singularmente a volver a crecer después de la lesión puede ser investigado por el acoplamiento en el seguimiento in vivo de dos fotones de imágenes con un modelo de lesión dirigida específicamente al axón de interés. Absorción multi-fotón de pulsos de femtosegundos se ha utilizado para interrumpir dendritas individuales o incluso espinas individuales 5,23. Por otra parte, este paradigma lesión permite cortar ramas axonales individuales sin interrumpir la dendrita de contactos 6. En el contexto de la disección de las características que permiten a la población neuronal específica de regenerar sus axones vez dañadas, las fibras trepadoras del cerebelo (SFC) son un modelo útil sina vez que retienen propiedades plásticas notables después de la lesión, incluso en los animales adultos 24,25. Recientemente, proyección de imagen a largo plazo de las FC mostró que estos axones son capaces de recrecimiento en los días que siguen a la axotomía láser 6.
Este protocolo describe cómo etiquetar las neuronas olivocerebellar y su elongación axonal a través de rastreo anterógrada. Una vez que las neuronas de interés están marcados con fluorescencia, que se pueden monitorizar varias veces en los puntos de tiempo arbitrarios para semanas o meses en virtud de una ventana craneal. El procedimiento para diseccionar ramas axonales individuales por axotomía láser in vivo A continuación, se ilustra.
Las técnicas presentadas aquí proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos de remodelación axonal in vivo y pueden ayudar al desarrollo de estrategias terapéuticas para limitar la degeneración neuronal y promover la regeneración axonal.
Este protocolo muestra cómo etiquetar las neuronas de la oliva inferior con un colorante fluorescente. Posteriormente, el método para llevar a cabo una ventana craneal en la corteza cerebelosa se describe. Esta técnica proporciona acceso óptico a la parte terminal de las neuronas olivocerebellar, las fibras de escalada. Por desgracia, el resultado de tanto el etiquetado y la cirugía craneotomía es bastante bajo, incluso en manos de operadores calificados (por lo general 1 de cada 3 ratones se etiqueta, y 1 de cada…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |