אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.
ביטוי לומד פעילות חלבון תלוי, טרנסלוקציה subcellular, או זירחון הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים תאיים הבסיסיים של פלסטיות הסינפטית. הגברה לטווח ארוך (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע"מ) מושרה בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות מקובלים מאוד כמודלים תאיים של למידה וזיכרון. ישנם מספר רב של מחקרים המשתמשים בגישות הדמיה תא או אימונוהיסטוכימיה חיות לדמיין דינמיקת חלבון תלויה פעילות. עם זאת שיטות אלו מסתמכות על התאמתו של נוגדנים לimmunocytochemistry או ביטוי יתר של חלבונים מתויגים הקרינה בתאי עצב בודד. Immunoblotting של חלבונים הוא שיטה חלופית המספקת אישור עצמאי של הממצאים. הגורם המגביל הראשון בהכנה של שברים subcellular מפרוסות בהיפוקמפוס tetanized פרט הוא הכמות הנמוכה של חומר. שני, הליך הטיפול הוא קריטי משום שמניפולציות גם מאוד קצרות וקלות של ליטרiving פרוסות עלולה לגרום להפעלה של מפלי איתות מסוימים. כאן אנו מתארים את זרימת עבודה מותאמת על מנת להשיג כמות מספקת של שבריר מועשר הגרעיני של טוהר מספיק מאזור CA1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות ממוח חולדה. כדוגמא מייצגת אנו מראים כי צורת ERK1 / 2 פוספורילציה של שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב באופן פעיל translocates לגרעין על אינדוקציה של LTP וניתן לאתרם בשבריר מועשר גרעיני מתאי עצב CA1.
Synaptic N-methyl-D-aspartate-קולטנים (NMDARs) לשחק תפקיד מכריע בפלסטיות הסינפטית והישרדות תא האיתות ואילו הפעלה של NMDARs extrasynaptic יכולים לגרום ניוון מוחיים ומוות של תאים. שינויים אלה תלויים בביטוי גנים תלויים / פעילות מוסדרת לפיקוח הדוק ולכן דורשים תקשורת מתמדת בין הסינפסות מופעלות או דנדריטים והגרעין 7. MAP קינאזות ERK1 / 2 הם effectors במורד הזרם של NMDARs הסינפטי איתות ומעורבות בביטוי גנים הנגרם על ידי NMDAR-הפעלה, ואילו איתות באמצעות NMDAR extrasynaptic יש השפעה מעכבת על ERK1 / 2 פעילות 8,11 לא או.
ישנם מספר החלבונים שהוכחו הסעות בין דנדריטים דיסטלי והגרעין. רבים מחלבונים אלו מכילים אות לוקליזציה גרעינית ומועברים באופן פעיל לאורך microtubuli בdynein ואופן importin תלוי לגרעין 6,9. Interestingly, כמה מהשליחים אלה מעבר רק לגרעין בתגובה לגירויים הסינפטי ספציפיים. לדוגמא, תחבורה מדרדר של אלמנט המחזורי AMP תגובה מחייב חלבון 2 (CREB2) היא מושרה על ידי בע"מ הכימי אך לא 12 LTP. גירוי הסינפטי NMDAR תלוי מקומי מניע coactivator מוסדר CREB תעתיק (CRTC1) לתוך הגרעין, תהליך טרנסלוקציה, העוסק בפלסטיות בהיפוקמפוס לטווח ארוך 4. זה היה הראה לאחרונה כי שליח החלבון יעקב translocates לגרעין אחרי שניהם, הפעלת NMDAR הסינפטי וextrasynaptic ומסדיר שעתוק הגנים תלויים CREB 5. המקור הסינפטי או extrasynaptic של האות מקודד בשינוי posttranslational של יעקב. פעילות הסינפטית גורמת ERK1 / 2 זירחון התלוי של יעקב בסרין מכריע בעמדה 180 (pJacobS 180) שבו הוא נחוץ לטרנסלוקציה לאחר הגרעין בתרבות בהיפוקמפוס העיקרית. יתר על כן, אניn נוירונים CA1 של pJacobS פרוסות בהיפוקמפוס חריפה 180 translocates לגרעין לאחר LTP טחונות שפר אך לא בע"מ 1,10. pS180 יעקב מוביל לביטוי מוגבר של גנים הקשורים פלסטיות וביטוי גנים זה הזנות חזרה לתפקוד הסינפטי. בניגוד חד, יעקב שtranslocates לגרעין לאחר הפעלת NMDARs extrasynaptic לא phosphorylated בSer180 ועשויה להיות קשורה לחלבון מורכב שונה בגרעין גורמת ל'CREB לכבות "ונסיגה של קשרים סינפטיים 10.
מחקרים שפורסמו ביותר על היבוא הגרעיני של שליח חלבון synapto-גרעיני נעשו בתרבויות עיקריות עצביות ניתק. לכן זה יהיה מעניין לראות אם ניתן לשחזר בממצאים כאלה מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי תנאי שימוש בפרוסות בהיפוקמפוס בי קישוריות ותפקוד עצביים הם הרבה יותר טוב נשמר. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להערכת LTP-deתלוי טרנסלוקציה הגרעינית של שליחי חלבון על ידי immunoblotting. שיטה זו מתאימה גם לניתוח זירחון התלוי פעילות של חלבונים בשבריר גרעיני גולמי. באופן ספציפי, את הפרוטוקול הנוכחי כרוך הכנת פרוסות חריפות בהיפוקמפוס CA1, אינדוקציה, והקלטה של LTP. בשלב הבא, אזור CA1 הוא גזור מיקרוסקופי כדי לבודד את האזור מגורה. שלבנו והותאמנו הפרוטוקול לבידוד גרעיני שסופק על ידי CellLytic גרעיני הפקת ערכה עם שינויים שהוכנסו על ידי זאו ועמיתים 17. הליך אופטימיזציה כולל תמוגה של אזורי CA1 גזורים במאגר hypotonic מאפשרת נפיחות תא ושחרור של גרעינים. תמוגה תא ומורפולוגיה גרעינים ניתן לקבוע על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העשרה גרעינית מושגת על ידי צעד צנטריפוגה קצר. Immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד NeuN וNSE2, סמנים ספציפיים של שברים גרעיניים או cytosolic, מצביע על כך שגישה זו יכולה לשמש כמהירהוהפרוטוקול לשחזור לבודד את השברים subcellular אלה וללמוד שינויי posttranslational מאוד יציבים כמו זרחון חלבון. בנוסף, בשיטה זו יש יתרון לדגימות רקמה קטנות הנובעות מאזורי CA1 גזורים של פרוסות בהיפוקמפוס וניתן להשתמש בו בשילוב לאימונוהיסטוכימיה של פרוסות בהיפוקמפוס.
השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל לספק הדרכה כיצד להכין חריף בהיפוקמפוס פרוס מחולדות צעירות או מבוגרים, לעורר והשיא LTP, במהירות לנתח אזור מגורה של הפרוסה, ולהכין חלק מועשר גרעיני ללימוד דינמיקת חלבון תלוי פעילות. גישה זו נובעת משילוב של מספר שיטות שונות המשמשות באופן ע?…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Table 1. Equipment | |||
CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
Axopatch 200B amplifier | Axon,USA | ||
Axon Digidata acquisition system | Axon,USA | ||
Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon,USA | ||
Leica microscope | Leica TCS SP2,Germany | ||
P-97 Standard microelectrode puller | Sutter,USA | ||
Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
SDS-PAGE system | BIORAD | ||
Cooler | JULABO | ||
Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
Cooler | Julabo, F12 | ||
Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
Small surgical scissors | |||
Scalpel | |||
Thin spatula | |||
Plastic Pasteur pipette | |||
Plastic culture dish | |||
Bunsen beaker | |||
Syringe | |||
Table 2. Reagents | |||
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
Phosphostop | ROCHE | ||
Bicuculline | Tocris bioscience | ||
Isofluran | Baxter | ||
Table 4. Antibodies | |||
Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
Secondary antibodies | Species | ||
IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |