Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini
Summary
Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente.
Abstract
Nonostante i rapidi progressi nella microscopia a high-throughput, saggi basati su immagini quantitativi pongono ancora sfide significative. Mentre una varietà di strumenti di analisi di immagine specializzati sono disponibili, la maggior parte dei flussi di lavoro basati-image-analisi tradizionali hanno curve di apprendimento ripide (per la messa a punto dei parametri di analisi) e determinano tempi lunghi di consegna tra imaging e di analisi. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in un'immagine, è un serio ostacolo al riguardo.
Qui vi presentiamo un supplente, workflow cellulare privo di segmentazione basata su PhenoRipper, una piattaforma software open-source progettato per l'analisi rapida ed esplorazione di immagini di microscopia. Il gasdotto qui presentato è ottimizzato per le immagini di microscopia di immunofluorescenza su colture cellulari e richiede un intervento minimo da parte dell'utente. Dopo mezz'ora, PhenoRipper può analizzare i dati da un tipico esperimento 96 pozzetti e generare profili immagine. Gli utenti possonopoi esplorare visivamente i dati, effettuare il controllo di qualità sul loro esperimento, garantire una risposta alle perturbazioni e verificare la riproducibilità dei replicati. Questo facilita un ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, che è fondamentale durante l'ottimizzazione del dosaggio. Questo protocollo è utile non solo come una prima analisi pass per il controllo di qualità, ma anche può essere usato come una soluzione end-to-end, in particolare per lo screening. Il flusso di lavoro qui descritto scalabile per grandi insiemi di dati come quelli generati da schermi high-throughput, e ha dimostrato di condizioni sperimentali raggruppare fenotipo con precisione su una vasta gamma di sistemi biologici. L'interfaccia PhenoBrowser fornisce un quadro intuitivo per esplorare lo spazio fenotipica e si riferiscono immagine proprietà alle annotazioni biologiche. Nel loro insieme, il protocollo qui descritto abbasserà le barriere per l'adozione di analisi quantitativa di schermi immagini based.
Introduction
Negli ultimi dieci anni, i rapidi progressi nella tecnologia di imaging hanno dato molti laboratori la capacità di effettuare la microscopia high-throughput. La sfida è ora spostato da una delle immagini di una delle analisi. Come possiamo caratterizzare, confrontare ed esplorare il torrente di complessi fenotipi ancora sottili generati da uno schermo di immagini high-throughput tipico?
Un certo numero di piattaforme di image-analisi e informatici hanno dato degli utenti toolbox sofisticati 1-3 per l'estrazione di informazioni biologiche da grandi raccolte di immagini. Eppure molti ostacoli significativi rimangono in analisi dei dati da schermi basati su immagine high-throughput. Difficoltà coinvolti con la scelta di opportune caratterizzazioni delle immagini e messa a punto dei parametri algoritmici (il sistema di interessi) spesso sfociano in lunghi tempi di installazione, in particolare per l'utente meno esperto l'analisi delle immagini. In particolare, la segmentazione delle cellule, il processo di identificazione di cellule individuali in unimmagine n, è un serio ostacolo al riguardo. La segmentazione può essere molto sensibili a parametri sperimentali, quali tipo di cellula, densità cellulare e bio-marcatori, e richiede frequentemente regolazione ripetuta per un grande insieme di dati. Per queste ragioni, analisi di immagine è spesso un passo terminale indipendente eseguita da specialisti piuttosto che una parte integrata del flusso di lavoro sperimentale. Questo preclude il ciclo di feedback rapido tra analisi e sperimentazione, una parte cruciale di sviluppo di analisi.
Qui si descrive un flusso di lavoro alternativo che è ottimizzato per high-throughput microscopia a fluorescenza ed evita molte delle difficoltà di cui sopra. A tal fine, ci avvaliamo di PhenoRipper 4, una piattaforma software open-source per una rapida esplorazione e l'analisi di immagini di microscopia. Significativamente, PhenoRipper evita molti dei problemi connessi con la segmentazione delle cellule, non tentare di identificare le singole cellule. Invece, PhenoRipper divide le immagini in pixelblocchi di dimensione subcellulare e caratterizza immagini in termini di blocchi che contengono. In particolare, PhenoRipper profili blocchi in termini di-base di colocalizzazione-marcatori caratteristiche e automaticamente identifica 4 tipi più rappresentativi di blocco nelle immagini di formazione. PhenoRipper poi assegna a ciascun blocco il tipo di blocco rappresentante più simile, e caratterizza finalmente immagini basate sui tipi di blocchi che contengono.
Rispetto agli approcci basati su celle singole-più tradizionali, questo approccio richiede la messa a punto minimo e competenza. Come tale, gli utenti devono solo impostare due parametri: la dimensione del blocco e una intensità soglia (per eliminare le parti non cellulari di un'immagine), entrambi i quali sono fissato con feedback grafico. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qui descritto è stato dimostrato da 4 a scalare facilmente ai set di dati molto più grandi, dove la velocità e la messa a punto minima fornisce grande tempo e guadagni di affidabilità. In pratica, troviamo che questa appscarafaggio riduce il tempo necessario sia per la configurazione e l'esecuzione da parte di più ordini di grandezza 4.
L'output primario di PhenoRipper è una rappresentazione visiva di immagine somiglianza, che consente all'utente di identificare gruppi di condizioni sperimentali che inducono le cellule da visualizzare fenotipi simili. I raggruppamenti PhenoRipper reperti hanno in genere comparabile "interpretabilità biologico" per quelli generati da più in termini di tempo, a base di cellule metodi 4. In pratica, ciò significa che spesso, nel giro di mezz'ora di eseguire un tipico esperimento di microscopia a fluorescenza a 96 pozzetti, uno sperimentatore, senza esperienza immagine-analisi preventiva può ottenere una lettura affidabile sulle prestazioni del suo esperimento. Lo sperimentatore può quindi iniziare ad esplorare le relazioni tra diverse condizioni sperimentali e relative tali relazioni per fenotipi di immagine.
Dimostriamo questo flusso di lavoro qui analizzando gli effettidi farmaci in diverse classi meccanicistiche sulle cellule HeLa colorati per DNA e del citoscheletro marcatori. Immagini di cellule trattate con la stessa classe di farmaci sono stati raggruppati insieme, e le immagini di scarsa qualità (artefatti di colorazione, su cellule di fuoco e così via) è apparso come valori anomali, che li rende facili da identificare e potenzialmente scartare.
Mentre questo flusso di lavoro è utile per un gran numero di saggi basati su immagini, ci sono chiaramente molte situazioni in cui un approccio diverso potrebbe potenzialmente essere più informativo. Per esempio, l'uscita dal PhenoRipper è principalmente un rapporto relativo di pattern di fluorescenza di tutti condizioni sperimentali. Se una caratterizzazione assoluta di uno specifico tratto della cellula singolo è stato invece richiesto (ad esempio il numero di macchiettature in una cella), una singola base di cellule analisi sarebbe necessario. Tuttavia, anche in questo tipo di situazione, PhenoRipper rischia di rilevare variazioni di questi fenotipi monocellulari e quindi essere un utile strumento per dosaggio ottimalezazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il flusso di lavoro qui descritto consente la caratterizzazione e comparazione di immagini di microscopia facile e veloce. In primo luogo abbiamo dimostrato come questo flusso di lavoro può aiutare l'ottimizzazione esperimento, per esempio eseguire rapidamente il controllo di qualità sulle immagini di microscopia. Successivamente, abbiamo dimostrato il suo potenziale per l'analisi high-throughput dati di screening: siamo stati in grado di droghe raggruppare in base al loro meccanismo d'azione. Il raggruppa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Adam Coster e tutti gli altri membri dei laboratori Altschuler e Wu per il feedback utili e discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Health concede R01 GM085442 e CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), e la Welch Fondazione I-1619 (SJA) e I-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
References
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