Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.
Meerdere processen zijn betrokken bij genexpressie waaronder transcriptie, translatie en de stabiliteit van mRNA en eiwitten. Elk van deze stappen wordt strak gereguleerd, waardoor de uiteindelijke dynamiek van eiwitgehalte. Verschillende regulerende mechanismen bestaan op het vertalen stap, waardoor mRNA niveaus alleen een onbetrouwbare indicator van genexpressie. Daarnaast heeft de lokale regulatie van mRNA translatie is vooral betrokken bij neuronale functies verschuiven 'translatomics' om de focus van de aandacht in de neurobiologie. De gepresenteerde methode kan gebruikt worden om de brug transcriptomics en proteomics.
Hier beschrijven we essentiële aanpassingen aan de techniek van polyribosome fractionering, die de translatome ondervraagt op basis van de vereniging van actief vertaald mRNA's om meerdere ribosomen en hun onderscheidend bezinken in sucrosegradiënten. Traditioneel werken met in vivo monsters, met name de central zenuwstelsel (CZS), is een uitdaging door de beperkte hoeveelheden materiaal en de aanwezigheid van vetweefsel componenten bewezen. Om dit aan te pakken, wordt de beschreven protocol specifiek geoptimaliseerd voor minimale hoeveelheid CZS-materiaal, zoals blijkt uit het gebruik van enkele muis ruggenmerg en de hersenen. In het kort worden CNS weefsels geëxtraheerd en vertalen ribosomen geïmmobiliseerd op mRNA met cycloheximide. Myeline beursgang wordt vervolgens uitgevoerd om vetrijke componenten te verwijderen. Fractionering wordt uitgevoerd op een sucrosegradiënt waar mRNA worden gescheiden volgens hun ribosomale laden. Geïsoleerde fracties zijn geschikt voor een scala aan downstream testen, met inbegrip van nieuwe genoom brede assay technologieën.
Genexpressie wordt bepaald door de gecombineerde werking van transcriptie, translatie en stabiliteit van mRNA en eiwitten, de vertaling met het meest overheersende effect 1. Het is nu duidelijk dat elk van deze stappen is sterk gereguleerd. Micro-RNA, vorming van RNA korrels, alternatieve en cytoplasmatische polyadenylatie zijn enkele voorbeelden van post-transcriptionele regulatie van genexpressie 2,3. Elk van deze mechanismen ontkoppelt transcriptie uit de omrekening en beïnvloedt het proteoom in het biologische systeem van belang. Dus, niet verwonderlijk, mRNA niveaus alleen zijn een imperfecte uitlezing van eiwit niveaus 4. Kwantitatieve proteomics biedt de meest directe bepaling van genexpressie, maar ondanks de recente ontwikkelingen, er nog steeds aanzienlijke beperkingen gevoeligheid en eiwitsequentie resolutie. Daarom is het aanpakken van de translatome, het repertoire van het vertalen van mRNA's, biedt een uitstekend compromis tussen het bestuderen van detranscriptoom en proteoom. Het is nauwkeuriger dan transcriptomics bij de beoordeling van de definitieve genexpressie, en biedt zowel hogere dekking en volgorde resolutie dan proteomics.
In zoogdiersystemen, de meeste vertaling gebeurtenissen beginnen via cap-afhankelijke initiatie. Een groep van eukaryote initiatie factoren samen met de 40S kleine ribosomale subunit verzamelen op kap van een mRNA de 5 '. Het complex scant vervolgens het mRNA en bij het bereiken van de startcodon augustus, werft de 60S grote ribosomale subeenheid vormen een complete 80S ribosoom. De rek fase verloopt het ribosoom bewegen langs het mRNA met verlengingsfactoren helpen de opname van aminozuren van geladen tRNA naar de ontluikende peptideketen. Meerdere ribosomen kan gaan langs een mRNA gelijktijdig en het aantal ribosomen verbonden is getoond te correleren met de mate van eiwitsynthese 5,6. Dit maakt ribosomal laden een betrouwbare indicatie voor translation en maakt scheiding van actief vertalen van mRNA's op basis van bezinking. Naast de kwantificering van het vertalen van mRNA's, kunnen sequentie-informatie worden verkregen motieven betrokken bij de vertaling regelgeving te identificeren. RNA ook bindende eiwitten en andere vertaling factoren kunnen worden geïsoleerd uit verschillende fracties, de studie en de ontdekking van verwante regulerende eiwitten vergemakkelijken.
In het zenuwstelsel is translationele controlesignalen gekoppeld aan processen zoals mRNA opslag, transport en plaatselijke eiwitsynthese. Groeikegels is aangetoond dat een bepaalde gelokaliseerde pool van mRNA onderscheiden van de rest van het axon 7 haven. Bovendien axonen bekwaam lokaal synthetiseren eiwitten 8,9. Als gevolg hiervan heeft de lokale controle van de vertaling uitgegroeid tot een cruciaal onderwerp van studie in de neurobiologie. Het potentieel van polyribosome fractionering deze pakken is geïllustreerd in verschillende studies, waarbij de techniek gebruikt omonderzoeken axon begeleiding in het ruggenmerg ontwikkeling, en toonde de activiteit-afhankelijke vertaling van BDNF in de hersenen 10,11.
Hoewel polyribosome fractionering is geen nieuwe techniek, het blijft een bijzonder uitdagend. Gebaseerd op het uitgangsmateriaal, kan aanzienlijk optimalisatie nodig zijn. Dit is vooral het geval voor in vivo CNS monsters, waarbij de hoeveelheid materiaal is vaak een beperking en vetweefsel componenten isolatie van het vertalen van mRNA's belemmeren. De meeste gepubliceerde protocollen fractionering behandelen gist of zoogdierlijke cellijnen, en er zijn vastgestelde protocollen voor de hersenen 12,13,14. In tegenstelling, zijn er nauwelijks publicaties waarin fractionering van het ruggenmerg, en eerdere protocollen vereisen ruggenmerg van een groot aantal dieren dat mag worden samengevoegd 15. Daarom werden een aantal essentiële aanpassingen aan de fractionering protocol aanpassen voor CNS weefsels, waaronder enkele muis ruggenmerg. Ribosoom immobilisatie met cycloheximide wordt uitgevoerd tijdens dier perfusie om dissociatie van ribosomen Durin voorkomeng het lange proces van weefsel-extractie. Vervolgens worden polysomal RNA geëxtraheerd in een bepaald wijze polyribosome maximaal rendement. Ten eerste gecontroleerde homogenisering van het weefsel door douncing, houdt de kern intact en voorkomt DNA verontreiniging. De kern wordt vervolgens volledig verwijderd door centrifugeren. De combinatie van detergentia NP-40 en natriumdeoxycholaat zorgt lysis van het endoplasmatisch reticulum en het vrijgeven van de membraan geassocieerde ribosomen. Bovendien, UV-absorberende componenten binnen de vetrijke myeline verdoezelen polyribosome profielen. Myeline beursgang is daarom noodzakelijk, waar dichte verbindingen zoals polyribosomen worden afgedraaid en lichtere verbindingen zoals myeline float en worden verwijderd 16. Polyribosomen worden vervolgens gesedimenteerd dan 17,5% tot 50% sucrose gradiënt. In plaats van het handmatig gelaagdheid en het bevriezen van elke sucrose laag, kan gradiënten ook worden bereid met behulp van een gradiënt mixer. Extractie van RNA uit fracties met zure fenol / chloroform maakt DNA worden verwijderd met minimale RNA verlies. Kunnen echter faseomkering plaatsvinden op dichte sucrose fracties (bovengenoemde component 16).
Dit protocol verschaft voordelen ten opzichte van andere conventionele werkwijzen die het niveau van translatie pakken. Bijvoorbeeld, zowel het meten van gefosforyleerde S6 (een prominente vertaling merker) en de etikettering van ontluikende ketens met radioisotopen geven informatie over wereldwijde vertaaldiensten niveau maar weinig zeggen wat specifiek wordt vertaald. Polyribosome fractionering, anderzijds, kan niet alleen de beoordeling van globale vertaling, maar ook de identiteit vertalen mRNA en bijbehorende regulerende eiwitten. Kwantitatieve real time PCR kan worden uitgevoerd op geïsoleerde RNA's voor een snelle uitlezing van geselecteerde mRNA, en microarrays en de volgende generatie RNA sequencing kan voor genoomwijde studies worden uitgevoerd. De hier gepresenteerde optimalisaties kan de techniek worden gebruikt met minimale hoeveelheden CNS weefsels derhalve verminderening het aantal dieren dat nodig is en het verbeteren van de algehele experimentele kwaliteit door het verminderen van weefsel verwerkingstijd. Aan de andere kant, kan deze techniek niet Outlook is geïnstalleerd ribosomen onderscheiden van het vertalen van degenen. Afschriften dragen vastgelopen ribosomen zal neerslaan in de zware fracties, en dit moet in gedachten worden gehouden bij het interpreteren van de gegevens.
Er zijn recent gerapporteerd technieken, namelijk RiboTaq en TRAP, waarbij ribosomen zijn gelabeld met epitoop tags of reporters respectievelijk een celtype-specifieke wijze en bijbehorende mRNA geïsoleerd door immunoprecipitatie 17,18. Deze techniek kan worden gekoppeld aan fractionering polyribosome hoge resolutie lezen voor specifieke celpopulaties bieden. Ribosoom mond-printen is een andere nieuwe techniek die nucleasedigestie gaat om kleine fragmenten te genereren, of "voetafdrukken", van mRNA's die worden beschermd door ribosomen. Bibliotheken worden vervolgens gegenereerd uit deze voetafdrukken en gesequenced. Deze methode provIDE een codon-specifieke Volledige genoomanalyse vertaling en kan vastgelopen ribosomen identificeren, niet-AUG start codon en kleine upstream open reading frames, die niet kan worden bereikt door fractionering polyribosome 19. Toch kan polyribosome fractionering worden gekoppeld aan ribosoom profilering voor isolatie van verteerd fragmenten die enkel ribosomen, dus verrijkend voor de moleculaire species die nodig is voor de bibliotheek preparaat waarin hoge zuiverheid van het monster is vaak nodig. Tezamen polyribosome fractionering is een flexibele methode blijvende betekenis en kan gekoppeld worden aan verschillende stroomafwaartse toepassingen, waaronder genomische assays zoals next-generation sequencing.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Systems Biology van Signalering in Cancer (Helmholtz Alliance op Systems Biology) en het Duitse Centrum van het Kankeronderzoek (DKFZ).
Hank’s balanced salts solution | Gibco | 14170-138 | |
Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm | Beckman Coulter | 331374 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma | D5758 | caution |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | danger |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | warning |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11697498001 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution | Sigma | 93482 | danger |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
Nonidet P-40 | Roche | 11332473001 | danger |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | warning |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion | AM9722 | danger |
GlycoBlue | Invitrogen | AM9516 | |
Equipment | |||
Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml | Wheaton | 357538/357542 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x g | Beckman Coulter | 331302 | |
Density Gradient Fractionator | Teledyne Isco | ||
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies |