Contrairement aux particules du VIH-1 sans cellules, les cellules T CD4 + infectées sont effectivement détectés par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Ce manuscrit décrit une méthode où les cellules périphériques mononucléaires du sang (PBMC) ou des pDC isolées sont co-cultivées avec le VIH-1 des cellules T infectées par détection d'évaluer innée par les pDC évaluée par la libération de l'IFN de type I.
VIH-1 détection innée nécessite un contact direct des cellules T CD4 + infectées avec des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Afin d'étudier ce processus, les protocoles décrits ici utilisent des cellules fraîchement isolées humains périphériques mononucléaires du sang (CMSP) ou des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) afin de détecter les infections dans les deux lignée de cellules T (MT4) ou des cellules primaires hétérologues T CD4 +. Afin d'assurer une bonne détection, il est essentiel que les PBMC sont isolés immédiatement après la collecte de sang et que le pourcentage optimal de cellules T infectées sont utilisés. De plus, la coloration multi-paramétrique par cytométrie de flux peut être utilisée pour confirmer que les échantillons de PBMC contiennent les différentes lignées cellulaires à des taux physiologiques. Un certain nombre de commandes peuvent également être inclus pour évaluer la viabilité et la fonctionnalité des pDC. Ceux-ci comprennent la présence de marqueurs de surface spécifiques, l'évaluation de la réponse cellulaire à agoniste connu des récepteurs Toll-like (TLR) voies, et confirmant l'absence de Spontané interféron de type I (IFN) production. Dans ce système, des PBMC fraîchement isolées ou des pDC sont co-cultivées avec des VIH-1 des cellules infectées dans des plaques à 96 puits pour 18 à 22 h. Les surnageants provenant de ces co-cultures sont ensuite utilisées pour déterminer les niveaux d'IFN de type I bioactives en contrôlant l'activation de la voie de ISGF3 dans des cellules HEK-Blue cellules / ß IFN-a. Avant et pendant des conditions de co-culture, les cellules cibles peuvent être soumis à une analyse par cytométrie flux afin de déterminer un certain nombre de paramètres, y compris le pourcentage de cellules infectées, les niveaux de marqueurs de surface spécifiques, et de tuer différentielle des cellules infectées. Bien que, ces protocoles ont été initialement développées pour suivre la production d'IFN de type I, ils pourraient être utilisés pour étudier d'autres molécules Imuno-modulatrices libérés de PDC et pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent le VIH-1 détection innée.
Type I IFN-production pDCs représentent la première ligne de défense contre les infections virales, et en tant que telle servent de lien vital entre l'immunité innée et adaptative 1. Bien que le VIH-1 sans cellule particules sont mal détectées par le système immunitaire inné, cellules T CD4 + HIV-1-infected sont effectivement détectés par les pDC 2. Le mécanisme de détection nécessite un contact initial entre la glycoprotéine d'enveloppe virale (gp120) à la surface de la cellule T infectée et molécules de CD4 sur le contrôleur principal, qui est ensuite suivie de la capture du virus et l'internalisation par les pDC. La reconnaissance ultérieure de transfert ARN VIH-1 par TLR7 déclenche l'activation de la / voie de IRF7 MyD88 et conduit à de type I production d'IFN 3 en fin de compte. Fait important, la seconde voie présente dans pDC de détection, qui est médiée par TLR9, est inhibé par l'interaction de la glycoprotéine virale gp120, avec le PDC spécifique marqueur de surface BDCA2 4.
<p class="jove_content"> Les TLR7 et TLR9 voies de détection de pDC peuvent éventuellement être modulés négativement par l'engagement de BST2 (également désigné Tetherin ou CD317) avec un autre inhibiteur de récepteur de surface spécifique pDC-ILT7 5. BST2 est exprimé à des niveaux élevés à la surface des pDC et certaines cellules cancéreuses, mais à des niveaux relativement plus bas à d'autres types de cellules, comme les cellules B, les macrophages et les lymphocytes T. Fait important, BST2 peut être induite par l'IFN de type I dans un certain nombre de lignées de cellules transformées ainsi que dans des cultures de cellules primaires d'origines humaines et murines 6. Outre sa fonction de régulation immunitaire, BST2 a récemment été trouvée pour inhiber la libération de VIH-1 et d'autres particules virales enveloppé par des particules virales naissantes de reticulation sur la surface des cellules infectées 7. Dans le cas du VIH-1, la protéine codée par le virus accessoire U (Vpu) a été représenté à agir comme un antagoniste de BST2. On pense que Vpu BST2 régule à la baisse de la surface cellulaire de cellules VIH-1 infectées par le site de son attacheing activité et par conséquent augmente le dégagement et la propagation virale 7, bien que cette notion a été contestée 8,9. En l'absence de Vpu, un grand nombre de descendants entièrement formés et matures du VIH-1 à particules sont retenues la surface de la cellule. Que ces particules captifs pourraient représenter des cibles efficaces pour la détection immunitaire reste encore une question ouverte. En outre, il est difficile de savoir si Vpu pourrait dysréguler production d'IFN-I Type de pDC par la surface moduler BST2 niveaux.Les premières études visant à évaluer le VIH-1 de détection ont été menées en utilisant sans cellules du VIH-1 particules, qui sont généralement considérés comme des inducteurs pauvres de type I IFN 3,10-12. Étant donné que les études récentes suggèrent que les CMSP et pDCs détectent efficacement infecté par le VIH lymphocytes T CD4 + 2,13,14, que nous décrivons ici une méthode simple pour mesurer les réponses innées déclenchées par pDCs sur la reconnaissance des cellules VIH-1-infected in vitro.
Les protocoles décrits ici mesurent détection de cellules T infectées par le GFP-tagged virus VIH-1 qui diffèrent seulement par leur capacité à exprimer Vpu, comme décrit dans notre récent rapport 18. Cependant, ces méthodes pourraient facilement être modifiés pour étudier détection de virus non marqués ainsi que les virus dépourvus d'autres gènes viraux qui pourraient moduler détection innée. Si les virus utilisés ne pas exprimer la GFP, le pourcentage de cellules cibles infectées doivent être déterminés par un autre moyen avant la co-culture, comme p24 (capside) coloration intracellulaire et cytométrie en flux ou par ELISA p24. Par ailleurs, ces protocoles peuvent être utilisés avec différentes cellules T cibles, y compris une variété de lignées cellulaires et des cellules primaires disponibles.
Les méthodes décrites dans ce manuscrit ont un certain nombre d'avantages par rapport aux premières méthodes utilisées pour étudier le VIH-1 de détection. Tout d'abord, il a été établi par un certain nombre de groupes que acellulaire VIH-1 pdes articles sont des inducteurs pauvres de type I IFN 2,13,14. En outre, les premières études comptaient sur les méthodes basées sur ELISA IFNa âgés de quantifier la quantité de type I IFN produit. Une limitation de cette technique de détection est que la plupart des kits ELISA IFNa âgés seule mesure un type d'IFNa, tout en donnant sur les autres types de IFNa et IFNß. L'utilisation des lignées de cellules rapporteurs décrits surmonte cette limitation que la concentration de toutes les formes bioactives de IFN humains de type I peut être mesurée à la fois. La technique est très sensible, moins cher que la nouvelle génération de kit ELISA IFN et pour de nombreux donateurs de grandes quantités d'IFN de type I peuvent être facilement détectés. Néanmoins, ce protocole peut être facilement adapté pour une utilisation avec d'autres type I IFN méthodes de lecture tels que ELISA.
Les étapes critiques: Il est important que la qualité de tous les composants cellulaires (deux cibles et effecteurs) être étroitement contrôlée. Contamination potentielle, même lorsque asympmatique, doit être surveillée et contrôlée. Comme nous l'avons mentionné précédemment, antibiotiques contrôlé contamination bactérienne asymptomatique, et potentiellement d'autres pathogènes intracellulaires tels que les mycoplasmes, peut générer des réponses immunitaires similaires à ceux observés après infection VIH-1, à savoir la production d'IFN de type I. En outre, tous les réactifs doivent être libres de LPS ou d'autres endotoxines potentiels. De même, le suivi des CMSP et pDC est également important car les échantillons humains peuvent souvent être amorcés par des infections en cours sous-jacents, qui peuvent affecter la détection normale. Nous vous recommandons de toujours, y compris les contrôles négatifs proposées, telles l'absence de cellules cibles ainsi que les co-cultures avec des cellules pseudo-infectées. La viabilité des cellules infectées est également important pour une détection correcte pDC depuis l'IFN de type I ne se produit après co-culture avec des cellules apoptotiques 2,14.
Une limitation importante de la technique est la nécessité pour les cellules primaires fraîchement isolées. Cette procédure n'a pas ététesté en utilisant CMSP ou pDCs qui ont été soit préalablement congelés ou maintenues en culture. L'isolement des PBMC est de main-d'oeuvre et ces cellules ont une durée de vie très limitée. En outre, des protocoles standards pour la protection contre les agents pathogènes transmissibles par le sang devraient être utilisées tout en travaillant avec du sang humain. Il ya souvent plusieurs sources de variabilité associées au travail impliquant des cellules humaines fraîchement isolées. Parmi eux se trouvent les différentes procédures mises en œuvre pour isoler ces cellules, et la variabilité hérité rencontrées du donneur à donneur. Bien qu'il soit impossible d'éviter la variabilité entre les bailleurs de fonds, l'utilisation des contrôles positifs proposées, telles que la mesure réponse à des agonistes connus de TLR7 et TLR9 voies, serait de fournir un contrôle interne important pour ces expériences. Nous avons observé qu'une réponse robuste à des agonistes TLR9 de la voie pourrait être corrélée avec une réponse pDC en bonne santé, tandis qu'une voie TLR7 sensibles est nécessaire pour une bonne réponse contre le VIH-1 3.
<p class = "jove_content"> Basé sur les observations faites par les États-Unis et d'autres 2, l'enrichissement des PDC à partir de PBMC est souvent pas nécessaire. Toutefois, si le protocole expérimental l'exige (par exemple dans le contexte où l'épuisement des marqueurs spécifiques de la surface est nécessaire pDC) sélection négative est préférable à une sélection positive, les cellules restent libres de l'anticorps après le processus de sélection. PDCs isolés apoptose rapide dans la culture. Pour les expériences qui ont besoin de ces cellules à cultiver pendant une période de temps prolongée, les milieux de culture peuvent être complétés avec de l'IL-3. Cette cytokine induit pDC prolifération et l'apoptose inhibe leur 16. Cependant, l'IL-3 utilisation doit être étroitement contrôlé car il peut conduire à la maturation des pDC ou la différenciation.La méthode décrite ici combine cible du VIH-1 des cellules infectées avec CMSP ou pDCs fraîchement isolés afin de recréer les étapes initiales impliqués pendant la détection innée. Cette méthode sera sans doute utile de Explore événements immunitaires innées précoces associés à l'infection à VIH. Bien que les protocoles associés visent à mesurer l'IFN de type I, ils pourraient facilement être modifiés pour mesurer d'autres molécules bioactives libérées de pDC lors de la reconnaissance des cellules infectées. Celles-ci peuvent inclure: l'IFN de type III (IFN-λ), cytokines pro-inflammatoires (telles que le TNF-α et IL-6) et le chimiokines CXCL10, CCL4, CCL5 et 17.
Nous remercions E. et J. Massicotte Seigneur pour l'assistance technique d'experts lors de la cytométrie de flux et les expériences de triage des cellules. Aussi, nous tenons à remercier le personnel de la clinique de l'IRCM et tous les donateurs pour fournir des échantillons de sang. Échantillons de sang périphérique ont été obtenus à partir de donneurs adultes en bonne santé qui ont donné leur consentement écrit conformément à la Déclaration d'Helsinki le cadre de protocoles de recherche approuvés par l'éthique de la recherche Conseil de l'Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM). Les réactifs suivants ont été obtenus grâce au Programme Réactif NIH sida, Division du sida, NIAID, NIH: cellules MT4 du Dr Douglas Richman; et rIL-2 humaine du Dr Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc.
Dr Cohen est le récipiendaire de la Chaire de recherche du Canada en rétrovirologie humaine. Ce travail a été financé par des subventions de l'IRSC (111226) au Dr Cohen et du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) réseau SIDA Dr Bego et le Dr Cohen.
MT4 cells | NIH AIDS Reagent Program | 120 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman. |
HEK-Blu IFN-α/β reporter cells | Invivogen | HKB-IFNAB | |
RPMI | Wisent | 350-000-CL | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
FBS | Wisent | 080-150 | |
Ficoll-Pâque Plus | Myltenyi | 17-1440-03 | |
CD4+ T cell isolation kit II | Myltenyi | 130-091-155 | |
Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II | Myltenyi | 130-097-240 | |
PHA-L | Sigma-Aldrich | O2769 | |
Human rIL-2 | NIH AIDS Reagent Program | 136 | This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann – La Roche Inc. |
Imiquimod | Invivogen | TLRL-IMQS | |
ODN 2216 CpG-A | Hycult Biotec | HC4037 | |
Human IFNα | PBL Interferon source | 11100-1 | |
QUANTI-Blue | Cedarlane | REP-QB2 | |
Flow cytometry (Antibodies/reagents) | |||
Fc blocking solution (composition below): | Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS) | ||
10% Goat serum | Sigma-Aldrich | G 9023 | |
10% Rabbit serum | Sigma-Aldrich | R 9133 | |
10% Mouse serum | Sigma-Aldrich | M 5909 | |
2.5 mg/ml human IgG | Sigma-Aldrich | I 4506 | |
anti-CD3_Pacific Blue | Biolegend | 300417 | |
anti-CD14_PE-TxRed | Life Technologie | MHCD1417 | |
anti-BDCA2_APC | Myltenyi | 130-090-905 | |
anti-ILT7_PE | Biolegend | 326408 | |
anti-CD4_PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317427 | |
anti-BST2_Alexa 660 | eBioscience | 50-3179 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P 6148 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
Equipment | |||
Cyan ADP instrument | Beckman Coulter | CY20030 |