Summary

عزل مزدوج السلبية خلايا T αβ من الكلى

Published: May 16, 2014
doi:

Summary

خلايا DNabT نادرة بين خلايا T الطرفية؛ ومع ذلك، فهي وفيرة في بعض الأنسجة اللمفاوية غير. صعوبة عزل خلايا T DN من الأنسجة اللمفاوية غير يعيق تحليلاتهم الفنية على الرغم من تزايد الاعتراف بأهمية الفسيولوجية المرضية. نحن تصف الرواية بروتوكول لعزل خلايا T DN العالية النقاء من الكلى الفئران.

Abstract

لا يوجد حاليا أي بروتوكول قياسي لعزل خلايا T DN من الأنسجة اللمفاوية غير على الرغم من مشاركتهم ذكرت على نحو متزايد في مختلف الاستجابات المناعية. خلايا T DN هي نوع من الخلايا المناعية الفريدة التي تورطت في تنظيم الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية والتسامح لallotransplants 1-6. خلايا T DN، ولكن، نادر في الدم المحيطي والأجهزة اللمفاوية الثانوية (الطحال والغدد الليمفاوية)، ولكن هم من سكان كبرى في الكلى طبيعية. القليل جدا هو المعروف عن وظيفتها الفسيولوجية المرضية 7 بسبب ندرة في الهامش. وصفنا مؤخرا تحليلا المظهري وظيفية شاملة لهذه الفئة من السكان في الكلى 8 في حالة مستقرة وخلال نقص التروية إصابة ضخه. تحليل DN T وظيفة الخلية سوف تتعزز بشكل كبير عن طريق وضع بروتوكول لعزلتهم من الكلى.

هنا، نحن تصف بروتوكول الرواية التي يسمح isolatioن من أساسها CD4 + CD8 + T خلايا نقي للغاية وخلايا T DN من الكلى الفئران. لفترة وجيزة، ونحن هضم أنسجة الكلى باستخدام كولاجيناز وعزل الخلايا وحيدات النوى الكلى (KMNC) من خلال الكثافة التدرج. ويتبع هذا من قبل اثنين من الخطوات لإثراء خلايا T المكونة للدم من 3٪ إلى 70٪ من KMNC. تتكون الخطوة الأولى من مجموعة مختارة إيجابية من الخلايا المكونة للدم باستخدام CD45 + عدة عزلة. في الخطوة الثانية، يتم عزل الخلايا T DN سلبا عن طريق إزالة الخلايا غير المرغوب باستخدام CD4، CD8، وMHC الدرجة الثانية الاجسام المضادة وCD1d α-galcer tetramer. هذه الاستراتيجية يؤدي إلى عدد سكانها أكثر من 90٪ نقية خلايا T DN. يستخدم تلطيخ السطح مع الأضداد المذكورة أعلاه يليها تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتأكيد نقاء.

Introduction

الطرفية αβTCR + CD3 + CD4 CD8 المزدوج السلبية وتنقسم الخلايا (DN) T إلى مجموعات فرعية مختلفة الظواهر التي تمتلك وظائف متميزة 1-4. فهم خلايا T DN سيئة ولكن على نحو متزايد بالتورط في الاستجابات المناعية المرضية في جسم المريض في نماذج الأمراض المختلفة 4-6.

خلايا T DN هي نوع من الخلايا المناعية الفريد الذي تورط على نحو متزايد في تنظيم مختلف الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية والتشكيل التسامح allotransplant. 4-6، 9 فهي نادرة في الدم المحيطي والأجهزة اللمفاوية الثانوية (الطحال والغدد الليمفاوية ). ومع ذلك، فهي سكان كبرى من الكلى والأمعاء الطبيعي الظهارة 10-12. القليل جدا هو المعروف عن وظيفتها 7 في الكلى في حالة مستقرة وتحت الظروف المرضية مثل إصابة الكلى الحاد (آكي) المرتبطة transpl الكلىالنمل.

بسبب أدوار معقدة من الخلايا المناعية المختلفة في تنظيم الاستجابات المناعية بما في ذلك alloresponses، وتحديد دور كل لاعب هو حاسم في فهم alloresponses وتصميم علاجات جديدة. نظرا لأعداد كبيرة من الخلايا T DN الحاضر في ظل ظروف مرض الكلى والفسيولوجية المختلفة، من المرجح أن تلعب دورا حاسما في تنظيم الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية في الفئران والبشر، وalloresponses في متلقي زرع خلايا T DN. على الرغم من تراكم الأدلة لا تزال متناثرة تورط خلايا T DN في كل المهام المسببة للأمراض والمثبطة للمناعة ولكن من المفهوم لماذا وكيف يعرضون وظيفة الضارة أو قمعية محددة وكيف يؤثر على البيئة لهم انها سيئة.

بسبب وفرة منخفضة في الكلى، وطرق تحسين العزلة ضرورية.

لا يوجد حاليا أي بروتوكول قياسي لعزل خلايا T من DN رانه الأنسجة اللمفاوية غير. يصف بروتوكول لدينا طريقة جديدة لعزل خلايا T DN من الكلى؛ ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لمختلف الأنسجة اللمفاوية غير.

Protocol

1. إعداد أدوات والثقافة وسائل الإعلام والكواشف الأدوات: إعداد الكواشف تحت ظروف معقمة واستخدام تحت غطاء تدفق الصفحي. تحضير 1 لتر من RPMI زراعة الأنسجة المتوسطة، إضافة 5٪ من مصل بقري جنيني، 2.1 غرا…

Representative Results

النوع البري C57BL / 6 (B6) الكلى يحتوي على حوالي 1،5-2،1 × 10 6 خلايا وحيدات النوى في الكلى. حوالي أقل من 10٪ هي المكونة للدم CD45 + الخلايا. لإعداد الخلايا وحيدات النوى الكلى (KMNC)، يتم قطع الكلى الى قطع صغيرة كما هو مبين في الشكل 1 متبوعا الهضم باستخدام 5٪ كولاجي?…

Discussion

وهناك اهتمام متزايد في خلايا T DN لأنها تورطه في ظروف مرضية مختلفة مثل اضطرابات المناعة الذاتية والسرطان والكسب غير المشروع والتسامح، وأمراض الكلى الأولية بما في ذلك إصابة الكلى الحاد (آكي)، التهاب كبيبات الكلى 8، 13. وبالتالي، هناك حاجة إلى فهم أفضل وتوصيف الوظا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في برنامج تلفزيوني (R21 AI095484). نشكر NHI مرفق الأساسية tetramer لCD1d tetramer.

Materials

Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37°C with 5% CO2)
Microscope  Olympus Or equivalent equipment 
Analytical flow cytometer LSR II 
Name of the reagent Company  Catalog  Number Comments 
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare  17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich  S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10X Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich  E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience  G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend   103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience  12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience  8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated BD 553143
anti-MHC class II (I-A d) biotinylated BD 553609
anti-CD1d PBS-57 tetramer NHI tetramer  lote # 15621-PBS57
AutoMACS Running Buffer-  MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys – Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70mc filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
Petri Dish  Fisher Scientific S33580
Plate 24 wells  BD Biosciences 354723

References

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

Play Video

Cite This Article
Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

View Video