Этот протокол описывает экспериментальную процедуру быстрого строительства искусственных факторов транскрипции (АССАЛХ) с родственными GFP репортеров и количественного определения способности АССАЛХ стимулировать экспрессию GFP через проточной цитометрии.
Синтетическая биология стремится рационально спроектировать и построить синтетические схемы с заданными количественными свойствами, а также предоставляет инструменты для допросить структуру родных цепей управления. В обоих случаях способность программы экспрессии генов в быстром и перестраиваемого образом, без мимо ворот эффектов, может быть полезным. Мы построили штаммов дрожжей, содержащие СИГН.1 промоутер вверх по течению кассеты URA3 последующим лиганд-связывающего домена рецептора человеческого эстрогена и VP16. При преобразовании этого штамма с линейным продукта ПЦР, содержащего ДНК-связывающий домен и выбора в отношении присутствии URA3, конститутивно экспрессируется искусственный фактор транскрипции (ATF) могут быть получены путем гомологичной рекомбинации. АССАЛХ сконструированные таким образом можно активировать уникальный ген мишень в присутствии индуктора, тем самым устраняя как мимо ворот активацию и нефизиологических условий роста, найденные с обычно используемой conditiрных систем экспрессии генов. Простой метод для быстрого строительства GFP репортерных плазмид, которые отвечают конкретно к нативной или искусственного фактора транскрипции интересующего также предоставляется.
Разработка генетических переключателей в дрожжах представляет большой интерес в научных и промышленных исследований. В идеальном случае, генетические переключатели могут использоваться для активации конкретного гена (или набор генов) только при желании экспериментатором. Последовательность, кодирующую ген, помещенный ниже по потоку от синтетического промотора не экспрессируется в отсутствие индуцирующего молекулы: при индуктора того ген должен быть быстро выражены. Это лишь недавно было показано, что такое переключение может быть спроектирован в дрожжах, где в отсутствие индуктора, штамм отображает фенотип удаления, но в присутствии индуктора, выражение активированного пропорционально уровню индуктора во всех клетках 1,2. Исторически сложилось так, условные системы экспрессии в дрожжах которые полагались на питательных аспекты последовательностей ДНК, в том числе МЕТ, PHO и GAL промоторов (деятельность которых чувствительны к внеклеточных уровней метионина, фосфата игалактоза, соответственно). В то время как условное выражение может быть достигнуто, это происходит за счет значительных плейотропных эффектов.
Гормональные рецепторы, такие как рецепторы человека эстрогена, оказались эффективными выключатели у эукариот 3,4. При отсутствии гормона, белок, слитый с рецептором гормона могут быть изолированы в цитоплазму, где он взаимодействует с шаперона Hsp90 комплекса. После связывания соответствующий лиганд, рецептор претерпевает конформационные изменения, в результате чего он будет выпущен из шаперонной комплекса Hsp90 и выявление сигнал ядерной локализации. Чтобы наблюдать динамику локализации того или иного рецептора, содержащих белок гормона, мы создали С-концевой слияние Gal4dbd.ER.VP16 (ГэВ, синтетического транскрипционного фактора, содержащего связывающий домен Gal4p ДНК, лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена человека , и VP16) с GFP 2. Ядерная локализация наблюдалась в 8 мин после добавлениянасыщая количеств индуктора, ß-эстрадиола, к которому дикого типа дрожжей полностью инертны. К этому времени, большинство клеток имеют четко видимые активные центры транскрипции для GEV генов-мишеней (анализировали с помощью флуоресценции в гибридизация), а также полностью зрелые мРНК 2,5. Гены-мишени GEV увеличилась в экспрессии> 2 раза в течение 2,5 мин 2,6 (измерено с использованием микрочипов), демонстрируя, что он принимает <2,5 мин для химерного активатора к транслокации в ядро, связывать ДНК и активировать транскрипцию.
В то время как несколько других на-переключателей были применены в дрожжах, которые используют различные мелкие молекулы или наркотики (в том числе классических доксициклин основе коммутаторов от кишечной палочки 7,8 и переключатель индиго на основе 9 из арабидопсис), ни один не добились скорости, специфичность, или теснота регулирования выставлены гормона основе коммутаторов. Стоит отметить, тшапка быстрый от-переключателей были также разработаны в дрожжах, и обычно работают путем слияния гена протеазы в убиквитинлигазы или последовательность 2,10,11,12 ориентации. Способность быстро удалить целевой белок из клетки облегчает исследование важных генов, а также гены, которые склонны к генетической подавления при удалении 10.
Методы, описанные в данном протоколе являются для строительства и характеризующие синтетические на-переключателей в дрожжах. Во-первых, мы покажем, как быстро генерировать геномно интегрированные гибридные белки, состоящие из ДНК-связывающего домена интереса, лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена человека, и VP16 (DBD-электромобилей). После нашего протокола, слитый белок экспрессируется из ACT1 промотора. Затем мы показываем, как создать узнаваемый репортер плазмиды для ATF и проверить ее функциональность, воспользовавшись проточной цитометрии. Хотя мы предполагаем эти репортер плазмиды используются с новыми АССАЛХ (рис. 1), они могут бе используется в качестве репортеров для родной активатор транскрипции, а также. Наконец, данные проверки эффекта активации АТФ на рост клеток в 96-луночных планшетах и для инженерных индуцируемые геномных аллелей предоставляются.
Коммутаторы гормонов основе, описанные здесь, имеют бесчисленные приложения, от изучения родного биологию клеток к тестированию на способность ДНК-связывающего домена интереса к целевым последовательность ДНК в естественных условиях. Система не имеет много привлекательных особенностей, включая градуированной ответ на индуктора, быстрых действий и жесткое регулирование (т.е.. Никакого измеримого неплотности, см. рисунок 7). Однако, есть еще возможности для совершенствования и расширения.
Последние работы в синтетической биологии подчеркнул мультиплексирования синтетических систем и расширение репертуара хорошо охарактеризованных, программируемых частей ДНК 16. Независимая, условное выражение различных генов-мишеней требует как несколько индукторов и связывающие домены ДНК, которые не имеют перекрывающиеся специфику. Наличие разработаны и природных рецепторов предоставляет большой набор частей, с которыми по разработке новых факторов искусственного транскрипции. РасширениеРепертуар взаимно ортогональных переключателей был весьма способствуют направленной эволюции подходов 17,18. В настоящее время усилия перепрограммировать лигандсвязывающий специфику наших искусственных факторов транскрипции будут представлены в будущем.
Ранее фенотипические последствия делеции гена / избыточной экспрессии были широко изучены в дрожжах 19,20. Тем не менее, он не был простым для изучения влияния выражения на разных фенотипов по всему диапазону уровней экспрессии. Основной особенностью системы, представленной в настоящем документе, его градуированная природа (рис. 8). В то время как часто предполагается, отношения между экспрессии генов и фенотипов интерес не обязательно может быть монотонной. Искусственные факторы транскрипции, такие как Z 3 EV и Z 4 EV сделает задачу анализируя фенотипические ответов на изменения в экспрессии генов простой.
Наконец, протоколы обсужденияред в этой рукописи для инженерно-характеризующие искусственные транскрипционные факторы, которые отвечают на β-эстрадиола, однако, важной альтернативой химически реагирующих доменов является использование света проблематики доменов (например, PhyB/Pif3, LOV и Bluf), , деятельность которых обратимы без возмущают среду для роста культуры 21-23. Системы на основе света облегчить пространственно-временной контроль экспрессии генов, белок-белковых взаимодействий, ионный транспорт и ферментативную активность, которая уже проверенную мощный 21-26.
В заключение мы представили методы для быстрого строительства индуцибельных, искусственных факторов транскрипции в дрожжах. Этот протокол обеспечивает шаблон для их конструкции в сочетании с родственными GFP репортеров, а также методов анализа данных репортер с помощью проточной цитометрии и анализируя эффект активации АТФ на рост.
The authors have nothing to disclose.
РСМ признает финансирование от NSF Высшей исследовательский грант. MBN признает финансирование от Льюиса-Sigler стипендий и наделенный даром Питера Льюиса. DB признает финансирование от NIH (GM046406) Национальный институт Генеральной медицинских наук Центра количественного биологии (GM071508). Мы признаем, Кристина DeCoste за помощь в проточной цитометрии экспериментов.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 11 732 650 001 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
Competent E. coli | Life Technologies | 18258-012 | |
Estradiol | Tocris Biosciences | 2824 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201 | |
PBS | Life Technologies | 10010-23 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
clonNAT | Jena Bioscience | AB-102L | |
XbaI | NEB | R0145S | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
Glucose | Fisher Scientific | D15-500 | |
Bacto-Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
Yeast Extract | BD Biosciences | 210929 | |
Agarose | BD Biosciences | 214010 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
G418 | Life Technologies | 11811-031 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
Lithium acetate dihydrate | Sigma-Aldrich | L-6883 | |
Salmon sperm DNA | Sigma-Aldrich | 93283 | |
PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Plasmids pMN8 and pMN10; yeast strain yMN15 | Noyes or Botstein labs | ||
Luria Broth | Sigma-Aldrich | L3397 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
LSRII Flow Cyometer | BD Biosciences | Various Models | |
MATLAB or FlowJo | MATLAB or FlowJo | Software for analyzing .FCS files from flow cytometry experiments | |
R | Open Source | For analyzing growth-rate data from plate reader. | |
Falcon Tubes | BD Biosciences | 352052 | |
1.7 ml Eppendorf Tubes | GeneMate | C3262-1 | |
250 ml Shake Flasks | Corning | 4446-250 | |
96-well, flat-bottom plates | Costar | 3635 | |
Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader) | BioTek | H1MG | |
Breathe-Easy Membranes | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
Thermocycler | various companies | Various models | |
SC-Ura powder | MP Biomedicals | 114410622 | |
5-FOA | Zymo Research | F9001-1 |