Summary

Высоко Решено Прижизненные Полосатый-подсветка микроскопия зародышевых центров

Published: April 09, 2014
doi:

Summary

Высокое разрешение прижизненной визуализации с повышенной контрастности до 120 мкм глубины в лимфатических узлах взрослых мышей достигается пространственно модуляции шаблон возбуждения мульти-координационного двухфотонного микроскопа. В 100 глубиной мкм мы измерили резолюции 487 нм (боковые) и 551 нм (осевой), в обход рассеяния и дифракции пределы.

Abstract

Мониторинг сотовой связи по прижизненной глубокие ткани многофотонной микроскопии является ключевым для понимания судьбы иммунных клеток в образцах толщиной ткани и органы в норме и патологии. Управляя шаблон сканирования в многофотонной микроскопии и применения соответствующих численных алгоритмов, мы разработали полосатый-подсветки подход, который позволил нам добиться в 3 раза лучше, осевое разрешение и улучшенную отношение сигнал-шум, то есть контраст, в более чем глубина 100 мкм ткани в сильно рассеивающих ткани лимфоидных органов по сравнению с стандартной многофотонной микроскопии. Скорость сбора, а также Фотообесцвечивания и фотоповреждения эффекты были подобны стандартным методом фотоумножителем основе, тогда как глубина визуализации была несколько ниже в связи с использованием полевых датчиков. Используя подход полосатый-освещения, мы можем наблюдать динамику иммунного комплекса отложений на вторичных фолликулов дендритных клеток ̵1; на уровне нескольких белковых молекул в зародышевых центров.

Introduction

Двухфотонное лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM), со своими преимуществами для глубокие ткани визуализации, связанной с инфракрасным ультра-короткого импульсного возбуждения 1, произвела революцию наш взгляд на жизненные процессы на уровне одноклеточного, раскрывая моторику и взаимодействия моделей различных сотовые подмножества в живых животных 2-5. Тем не менее, современные технологии по-прежнему недостаточно для выяснения механизмов функции органа и дисфункции в качестве предпосылки для разработки новых терапевтических стратегий, так как он оказывает только недостаточной информации о молекулярной основе клеточного ответа в тканях в норме и патологии. Современная технология позволяет только пространственное окно несколько сотен микрон из-за рассеяния и волновые фронты эффекты искажения на пространственное разрешение и отношение сигнал-шум 6, которые особенно очевидны в очень компактной ткани взрослых животных. Эти рассеяния и волновые эффекты передние искажения обусловлены весьма неоднородной апг анизотропной распределение показателя преломления в ткани, приводит в качестве первого шага на глубину зависимого ухудшения 3D пространственным разрешением и, наконец, к полной потере сигнала, приходящего из баллистических фотонов возбуждения, то есть потери отношением сигнал-шум. С точки зрения bioscientific и приложений биомедицинских глубокой ткани, это означает, что в настоящее время технологии не в состоянии однозначно выявить сотовой связи, потому что плохое разрешение приведет к ложно положительных взаимодействий в то время как снижение отношения сигнал-шум вызовет система выйти на некоторые взаимодействия между тусклыми структур.

Для того, чтобы однозначно обнаружить клеточные взаимодействия в динамике, значительно улучшены пространственное разрешение необходимо глубоко в ткани. В настоящее время введены мощные методы Наноскопия на основе специальных алгоритмов численного, например подходов структура-освещения, на истощение первого возбужденного состояния, например </em> STED, RESOLFT или по локализации молекул, например dSTORM, PALM, нашли множество применений в основной клеток, а также в культурах живых клеток 7. Тем не менее, для того чтобы расширить эти приложения, чтобы срезах тканей, живой ткани и организмов мы все еще должны преодолеть серьезные технические трудности. Двухфотонное возбуждение STED с различными длинами волн, а также с одной длине волны (sw2PE-STED) возбуждения и стимулированное излучение было применено для улучшения пространственного разрешения в срезах мозга 8 или в искусственных матриц с внедренными клеток 9, соответственно, в то же осевое разрешение в качестве стандартного TPLSM. Использование одного фотона STED, динамика дендритных шипиков могли быть отображены на поверхности коры головного мозга (до 10-15 глубины мкм) в живом Thy1 EGFP мыши с разрешением 67 нм 10. Универсальный инструмент для биологии развития обеспечивается мультифокальной структурированной подсветки микроскопии, которая обеспечивает двукратное улучшение 2Dразрешение. Однако этот метод может быть использован только в организмах с низкой склонностью рассеяния света, таких как рыба-зебра эмбрионов 11. Тем не менее, ни один из этих методов не может быть применен в высококвалифицированных рассеяния ткани взрослых животных в несколько сотен микрометров, которые имеют решающее значение модели для биомедицинских и клинических исследованиях заболеваний с начала после рождения.

Независимо от используемого приближения для расчета дифракционной волны форму передней части, то есть функции размытия точки (PSF), после фокусировки через объектив, ширина PSF вдоль оптической оси (резолюция осевая), по крайней мере в три раза больше, чем ширина PSF, перпендикулярной к оптической оси (пространственным разрешением) 12. Волнового фронта искажения различных порядков количественно коэффициентов Цернике в значительно изменить волнового фронта форму целенаправленной электромагнитной волны в визуализации глубокие ткани, ведущие к гораздо более крупных PSFs, особенно вдоль оптическойаль оси 13-15. Таким образом, оба законы дифракции и эффекты волнового фронта искажения указывают на разрешение вдоль оптической оси, что и ограничивающим фактором в области обработки изображений глубокие ткани. В то время как Наноскопия методы сосредоточиться на противодействии пределы дифракции только, технология, которая улучшает осевой разрешение и контрастность по противодействию как дифракцию и волнового фронта эффекты искажения необходим для прижизненной визуализации с высоким разрешением. В идеале, эта методика должна быть также достаточно быстро, чтобы позволить контролировать клеточной динамики.

В режиме реального времени коррекция ФСФ аберраций и потери контраста с помощью адаптивной оптики в TPLSM была тщательно изучена и улучшение в последнее десятилетие 13,14,16-18 и поэтому лучшими в настоящее время выбор ведет к более эффективному управлению баллистической возбуждения фотоны 14. Тем не менее, в связи с тем, что большинство волнового фронта коррекции подходов, используемых в адаптивной оптики носят итеративный и что они гаве повторить для небольших участков (несколько 10 х 10 мкм 2) в связи с высокой неоднородностью показателя преломления в ткани, скорость приобретения значительно ниже, чем необходимо для визуализации клеточной подвижности и связи. Кроме того, физический предел в адаптивной оптической улучшилось TPLSM по-прежнему определяется дифракции.

Пространственная модуляция освещения (SPIN) и временной модуляции на стороне обнаружения (плоские) были теоретически предлагается применять к лазерной сканирующей микроскопии, чтобы улучшить качество изображения. Их практическое применение в прижизненной визуализации еще предстоит продемонстрировали 19.

Взятые вместе, существует высокая потребность в разработке технологий, которые улучшают разрешение для глубокие ткани визуализации в живых взрослых животных. В этой работе, мы достигаем пространственной модуляции картины возбуждения контролируя процесс сканирования в многолучевой полосатый-подсветка многофотонное лазер-хконсервирование микроскопии (MB-СИ-MPLSM) 20. Вопреки структурированных подходов освещения, в которых раздел возбуждения крест луч пространственно-модулированных, мы используем только процесс сканирования для достижения пространственной модуляции возбуждения. Расширяя возбуждение в большей длиной волны, мы можем улучшить и пространственное разрешение и отношение сигнал-шум в глубокой ткани сильно рассеивающих тканей (например, лимфатический узел, путь свободного рассеяния 47 мкм 6), независимо от оптических нелинейный сигнал мы обнаруживаем, например флуоресценция, генерация второй гармоники или другой частоты смешивания явление. Используя этот подход на длинах волн возбуждения до 900 нм мы можем динамически изображения сотовой белковые структуры в масштабе нескольких молекул в зародышевых центрах мыши лимфатических узлов. Таким образом, мы можем лучше представить себе взаимодействие между антиген проведения единиц на поверхности фолликулярных дендритных клеток и В-клеток в процессе зондирования антиGen в течение иммунного ответа в вторичных лимфоидных органах.

Protocol

Настройка многолучевой для Полосатая-освещения TPLSM Установка используется здесь является специализированным многолучевой двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа, как описано выше 6,20. Система показано на рисунке 1. Подход может быть применен к д?…

Representative Results

Пространственное разрешение в лимфатических узлах Размеры эффективной функции рассеяния точки (EPSF) соответствуют пространственным разрешением микроскопом 12. Мы измерили эту трехмерную функцию путем приобретения второго поколения гармоники сигнала коллагеновых…

Discussion

Цель прижизненной оптических изображений является динамически и функционально визуализировать сотовой моторику и взаимодействия, чтобы понять ткани и функции органов в норме и при патологии 5. Наиболее мощная технология для достижения этой, многофотонной лазерной сканирующей …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Р. Heintzmann за плодотворные обсуждения в ходе разработки подхода полосатый-освещения, К. Rajewsky и А. Хаберман для обеспечения C57BL / 6 В1-8 GFP трансгенных мышей. Мы признаем Deutsche Forschungsgemeinschaft по гранту NI1167/3-1 (РН), HA5354/4-1 и SFB633, проект A15 (к AEH), Шарите под гранта Рахель-Хирша общения (к RN) за финансовую поддержку. Мы особо отметить сетевой Jimi за плодотворные обсуждения и инфраструктурной поддержки

Materials

ATTO590 – NSH for coupling ATTO Tec, Germany AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 DRFZ, Berlin The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+ Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment  StemmCell Technologies, Germany 19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm Life Technologies, Germany F8803
Name of Equipment Company Catalog Number Comments/Description
TriMScope I LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version) APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II Coherent, Duisburg, Germany
water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm Olympus Germany, Hamburg, Germany

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
  3. Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
  4. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  6. Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
  7. Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
  8. Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
  9. Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation – stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
  10. Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
  11. York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
  12. Gu, M. . Advanced optical imaging. , (2001).
  13. Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
  14. Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
  15. Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
  16. Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
  17. Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
  18. Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
  19. Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
  20. Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
  21. Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).

Play Video

Cite This Article
Cseresnyes, Z., Oehme, L., Andresen, V., Sporbert, A., Hauser, A. E., Niesner, R. Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers. J. Vis. Exp. (86), e51135, doi:10.3791/51135 (2014).

View Video