בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה
Summary
כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.
Abstract
למרות הזמינות של טיפול וחיסון, שחפת (שחפת) נשאר אחד הזיהומים החיידקיים הקטלניים הנפוצים ביותר בעולם. מאז כמה עשורים, ההתפרצות הפתאומית של זנים עמידים לתרופות מרובות ונרחבות היא איום רציני על השליטה בשחפת. לכן, חיוני לזהות מטרות ומסלולים חדשים קריטיים עבור הסוכן הסיבתי של השחפת, שחפת Mycobacterium (Mtb) ולחפש כימיקלים חדשניים שיכולים להפוך לתרופות שחפת. גישה אחת היא להקים שיטות המתאימות למסכים הגנטיים והכימיים של ספריות בקנה מידה גדול המאפשרות חיפוש מחט בערימת שחת. למטרה זו, פיתחנו בדיקה פנוטיפית המסתמכת על זיהוי של Mtb שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית. בדיקה זו במבחנה מאפשרת כימות מבוסס תמונה של תהליך הקולוניזציה של Mtb לתוך המארח היה אופטימיזציה עבור פורמט microplate 384-well, אשר מתאים למסכים של siRNA-, תרכובת כימית- או Mtb מוטציה ספריות. התמונות מעובדות לאחר מכן לניתוח רב-פרמטרי, המספק הסקת מסקנות על הפתוגנזה של Mtb בתוך תאים מארחים.
Introduction
בין הפתוגנים זיהומיות המתעוררים המתעוררים מחדש שדווחו בשנים האחרונות, שחפת Mycobacterium (Mtb) מחזיק מקום בולט להיות אחראי על 1.4 מיליון מקרי מוות ו 8.7 מיליון זיהומים חדשים בשנת 2011 (דו”ח שחפת גלובלית 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). למרות הזמינות של טיפולים multidrug, מספר האנשים הנגועים עדיין במגמת עלייה ועמיד multidrug (MDR) כמו גם עמידים לתרופות נרחב (XDR) Mtb מתפשטים במהירות בכל רחבי העולם1. יתר על כן, כאשר לוקחים בחשבון את נוכחותם של אנטיגנים Mtb, ברור כי שליש מהאוכלוסייה העולמית נחשב נגוע סמוי על ידי Mtb. סטטיסטית, במקרה אחד מתוך עשרה, יש אבולוציה לקראת הצורה הפעילה של המחלה עם הסימפטומים הקליניים הבאים2. לכן, אמצעים חדשים להילחם Mtb נדרשים בדחיפות. בהקשר זה, פיתחנו מבחנה פנוטיפית ויזואלית במבחנה המסתמכת על ניטור פלישת Mtb וכפל לתאים מארחים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית אוטומטית3. ההתאמה של הבדיקה בלוחות מיקרוטיטר 384-גם בשילוב עם רכישת תמונה אוטומטית וניתוח, אפשר תוכן גבוה / תפוקה גבוהה הקרנה (HC / HTS) של ספריות בקנה מידה בינוני של תרכובות, siRNAs ומוטנטים חיידקיים. ההקרנה של ספריית RNAi רחבת הגנום בבדיקה פנוטיפית זו אפשרה ובכך לזהות את הגורמים המארחים העיקריים המעורבים בסחר Mtb ושכפול תאיים, אלא גם את ההבהרה של מסלולים מארחים המנוצלים על ידי bacillus פקעת. הסתגלות נוספת של בדיקה פנוטיפית מסוימת זו הייתה לזיהוי גורמים חיידקיים החיוניים להתמדה תוך-פאגוזומלית של Mtb. לדוגמה, מעצר התבגרות phagosome נחשב לאחד המנגנונים העיקריים המאפשרים את הישרדותו ושכפולו של Mtb במקרופג’. ניטור של לוקליזציה תת תאית של מוטציות נוקאאוט Mtb בתאים פלואורסצנטי שכותרתו חומצית מותר לזיהוי של גנים חיידקיים המעורבים בתהליך ההישרדות4. לבסוף, הדמיה בתכולת גבוהה של Mtb מציעה גם שיטה מצוינת לכמת יעילות התרופה לעיכוב תופעות שונות כמו צמיחת חיידקים תאיים3. בסך הכל, סוג זה של תפוקה גבוהה phenotypic assay מאפשר האצת גילוי סמים נגד שחפת ואת הנתונים שנאספו על ידי גישות שונות אלה לתרום להבנה טובה יותר של מניפולציה המארח המופעל על ידי Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים כאן את השיטות הנדרשות לבדיקה פנוטיפית באמצעות זן Mtb H37Rv מבטא GFP כדי להדביק תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית, מה שהופך אותו מתאים למסכי תוכן גבוה / תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של תרכובות, בדיקות פלואורסצנטיות ומוטנטים Mtb. עבור כל פרוטוקול שתו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה כספית לעבודה זו סופקה על ידי הקהילה האירופית (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, מענק MM4TB n° 260872), סוכנות לאומית דה Recherche, פדר (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), ואת האזור נורד פאס דה קאלה. אנו מודים בהכרת תודה על הסיוע הטכני של גספר דלויסון, אליזבת ורקמייסטר, אנטונינו בונג’ובאני ופרנק לאפונט מפלטפורמת BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
