Summary

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em> In Vitro</em> Aderenza Assay

Published: April 28, 2014
doi:

Summary

In vitro aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di Streptococcus pneumoniae di monostrati di cellule epiteliali e di indagare potenziali interventi quali l'uso di probiotici per inibire la colonizzazione pneumococcica.

Abstract

L'aderenza di Streptococcus pneumoniae (pneumococco) al rivestimento epiteliale del rinofaringe può provocare colonizzazione ed è considerato un prerequisito per infezioni pneumococciche quali polmonite e otite media. Saggi in vitro di aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di pneumococchi a cellule epiteliali monostrati e di indagare potenziali interventi, come l'uso di probiotici, per inibire la colonizzazione pneumococcica. Il protocollo qui descritto viene usato per studiare gli effetti della salivarius Streptococcus probiotico dall'adesione dei pneumococchi alla linea cellulare epiteliale umano CCL-23 (talvolta indicato come cellule HEp-2). Il test prevede tre fasi principali: 1) la preparazione delle cellule epiteliali e batteriche, 2) l'aggiunta di batteri per monostrati di cellule epiteliali, e 3) individuazione di pneumococchi aderenti da conte vitali (diluizione seriale e placcatura) o quantitativa real-time PCR (qPCR ). Questo technique è relativamente semplice e non richiede attrezzature specializzate diverso da una configurazione coltura tissutale. Il test può essere usato per testare altre specie probiotiche e / o potenziali inibitori di colonizzazione da pneumococco e può essere facilmente modificato per affrontare altre questioni scientifiche riguardanti l'adesione pneumococcica e l'invasione.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è un batterio Gram-positivi che possono causare infezioni, tra cui la polmonite, otite media, e la meningite. E 'una delle principali cause di malattia nei bambini nei paesi a basso reddito e responsabile di circa 800.000 decessi di bambini sotto i cinque anni ogni anno 1. Pneumococchi sono spesso effettuato nel nasofaringe dei bambini. Sebbene questa colonizzazione è generalmente considerato asintomatica, precede infezione pneumococcica e funge da serbatoio per i batteri in popolazioni umane 2. Vaccinazione pneumococcico coniugato riduce efficacemente il trasporto dei sierotipi contenuti nel vaccino. Tuttavia, ci sono più di 90 sierotipi di pneumococco, e la vaccinazione può portare alla sostituzione sierotipo, per cui l'eliminazione dei sierotipi del vaccino è seguita da un aumento della carrozza e malattia causata da sierotipi non vaccinali 3. Inoltre, in alcune popolazioni ad alto rischio, pneumococcocolonizzazione si verifica spesso molto presto nella vita, prima della somministrazione della prima dose di vaccino di 4,5. Recentemente, l'uso di probiotici è stata proposta come una strategia aggiuntiva per inibire pneumococcica colonizzazione 6,7. Saggi in vitro di aderenza sono stati utilizzati per esaminare l'adesione pneumococcica 8,9. Questi test sono stati adattati per studiare l'impatto del probiotico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sull'adesione pneumococcica 10.

Oltre a LGG e altri batteri lattici, Streptococcus salivarius, residente comune della cavità orale, è stato studiato come potenziale probiotico per le vie respiratorie a causa della sua potenziale colonizzazione e capacità di inibire pneumococchi e altri patogeni respiratori in vitro 11 – 13. Il protocollo presentato qui descrive un test aderenza utilizzato per studiare gli effetti di S. salivarius K12 sul rispetto pneumococcoalla linea cellulare epiteliale umano CCL-23. Prima di usare nel saggio, isolati pneumococco sono stati valutati per le capacità di aderenza, come la crescita e le proprietà di aderenza può variare notevolmente tra gli isolati 10,14. Curve di crescita di pneumococchi e S. salivarius sono stati eseguiti per determinare fase mid-log e concentrazione stima (unità formanti colonie o CFU / ml) di densità ottica (OD, Figura 1). Si raccomanda di esaminare crescita conteggio e OD valida per ogni isolato prima dell'uso nel saggio. Questa analisi può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con impianti di coltura di tessuti standard e attrezzature. In questo protocollo, gli effetti di tre dosi di S. salivarius somministrato 1 ora prima dell'aggiunta di pneumococchi sull'aderenza di S. pneumoniae PMP843, un sierotipo 19F carrozza isolato derivata da un tampone nasofaringeo, sono esaminati. Due modi diversi di quantificare pneumococchi aderenti sono presentati: placcatura su agar sangue per scoraggiareil mio conte vitali, e l'estrazione del DNA e la rilevazione del pneumococco LYTA gene da qPCR 15. Il protocollo di base saggio aderenza può essere facilmente modificato per testare diverse dosi o tempo di somministrazione di probiotici e può essere utilizzato anche con altri ceppi batterici o specie.

Protocol

1. Preparazione delle cellule epiteliali e batteriche Scongelamento dei CCL-23 cellule epiteliali Preriscaldare Minimum Essential media (MEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) in un bagno d'acqua a 37 ° C per ~ 30 min. Sterilizzare l'armadio biosicurezza cultura approvato tessuto con luce UV per almeno 10 minuti prima dell'uso, e pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo. Pulire la bottiglia mezzi riscaldato con il 70% di etanolo e posto in armad…

Representative Results

I risultati di un esperimento rappresentativo in cui pneumococchi (S. pneumoniae PMP843, un colonizzando 19F isolare) sono stati aggiunti al CCL-23 cellule 1 ora dopo l'aggiunta di S. salivarius, e l'adesione pneumococcica è stata quantificata sia conta vitale e Lyta qPCR sono mostrati in Tabella 2. risultati erano coerenti tra i due metodi sia per il numero assoluto di batteri (presentato come CFU / ml) e l'aderenza%, normalizzato al numero pneumococchi di aderen…

Discussion

Una parte critica di questo saggio è l'aggiunta concentrazioni appropriate di S. salivarius e pneumococchi nelle sezioni 3.1.7 e 3.1.12. Le concentrazioni sono stimate utilizzando le letture di OD, ma l'inoculo esatto non sono determinati fino piastre vengono conteggiati il ​​giorno seguente. Per questo motivo, si consiglia di eseguire curve di crescita per misurare OD e conta vitali (CFU / ml) nel tempo per tutti i ceppi batterici utilizzati nel test per identificare la fase di mid-log e assistere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Murdoch Childrens Research Institute e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria.

Materials

Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03
T-75 Flask Nunc 156472
CCL-23 cells ATCC CCL-23
Trypsin Life Technologies 15090046
24-well cell culture plate Nunc 142475
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Disposable cuvettes Kartell 1938
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL
sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901
Proteinase K Qiagen 19133
SDS 20% solution Ambion AM9820
RNase A Qiagen 19101
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880
Thermo-Fast 96 Detection plate Thermo Fisher Scientific AB-1100
Ultra clear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449
* alternative sources are available for most/all products listed

References

  1. O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. d. G. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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