Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.
Drosophila melanogaster is een krachtig modelsysteem dat wijd gebruikt om een verscheidenheid van biologische processen helderen. Zo hebben studies van zowel de vrouwelijke als mannelijke kiemlijnen van Drosophila mate bijgedragen tot de huidige kennis van meiose en stamcel biologie. Uitstekend protocollen zijn in de literatuur voor de isolatie en beeldvorming van Drosophila eierstokken en testes 3-12. Hierin, methoden voor de dissectie en voorbereiding van Drosophila testes voor microscopische analyse worden beschreven met een begeleidende video demonstratie. Een protocol voor het isoleren testes uit de buik van volwassen mannetjes en voorbereiden slides van levend weefsel voor analyse door fase-contrast microscopie en een protocol voor het bevestigen en immunokleuring testes voor analyse door fluorescentiemicroscopie worden gepresenteerd. Deze technieken kunnen in de karakterisering van Drosophila mutanten die d vertonen worden toegepastefects in spermatogenese en in de visualisatie van subcellulaire lokalisatie van eiwitten.
Drosophila testes zijn een ideaal model voor de studie van vele biologische processen, waaronder de regulering van stamcellen, meiose en spermaontwikkeling 13-18. De spermatocyten en hun meiotische spindels zijn groot en dus handig voor cytologische analyse en ontspannen celcyclus checkpoints tijdens spermatogenese vergemakkelijken de studie van mutaties in genen van de celcyclus. Verschillende celtypen kunnen in geordende progressie worden genomen over de lengte van de testes en eventuele verstoring van spermatogenese kan leiden tot veranderingen in de algemene regeling. Deze eigenschappen, gecombineerd met Drosophila genetische hulpmiddelen hebben de mutatie-analyse van de spermatogenese 21-23 vergemakkelijkt.
De stadia van Drosophila spermatogenese goed zijn afgebakend. Germlinecellen dat synchroon ontwikkelen binnen cysten vooruitgang achtereenvolgens door de stadia van spermatogenese langs de lengte van de testis. Tijdens both de mitotische en meiotische delingen van de mannelijke geslachtscellen, cytokinesis optreedt onvolledig, zodat de dochtercellen blijven verbonden door cytoplasmatische bruggen bekend als grachten (figuur 1). De apicale uiteinde van de testis bevat een bevolking van kiembaan stamcellen die aanleiding geeft tot spermatogonial cellen, die vier mitotische delingen ondergaan met onvolledige cytokinesis tot 16-cel cysten van primaire spermatocyten genereren. Na premeiotic S-fase, primaire spermatocyten voer G2, een langere groeiperiode van ~ 90 uur gedurende welke cellulaire volume toeneemt ~ 25-voudig. Progressie door meiose I en meiose II resulteert in de vorming van 32-cellen cysten secundaire spermatocyten en 64-cellen cysten haploïde spermatiden respectievelijk. De onvolwassen, ronde spermatiden ondergaan uitgebreide cellulaire verbouwing tot rijpe zaadcellen vormen. Post-meiotische cellen, in het bijzonder de bundels van het verlengen en volwassen spermatiden, bezetten een groot deel van het volume van de testis.
Thij succesvol transport van functionele zaadcellen aan vrouwelijke vliegen vereist coördinatie tussen de verschillende delen van het mannelijke voortplantingssysteem, die is samengesteld uit verschillende afgestemde structuren (de testes, zaadblaasjes, en accessoire klieren) en een enkele ejaculatie kanaal (figuur 2). Zaadcellen worden geproduceerd in de testes en opgeslagen in de zaadblaasjes tot copulatie 24. Het accessoire klieren bevatten secretoire cellen die zaadvocht produceren. Het sperma migreren van de zaadblaasjes gemengd met zaadvloeistof binnen de ejaculatie kanaal, die is aangesloten op de zaadblaasjes en de accessoire klieren. Dit mengsel van sperma en zaadvloeistof uiteindelijk uit de mannelijke gepompt in de vagina van het vrouwelijke vliegen door de ejaculatie lamp bij het achterste uiteinde van de mannelijke buik 25. Eiwitten in het zaadvocht zijn essentieel voor de langdurige opslag van sperma binnen gespecialiseerde organen bekend als spermathecae in de reproductive darmkanaal van Drosophila vrouwen 26.
Uitstekende werkwijzen voor de isolatie van Drosophila testes en visualiseren van cellen in verschillende stadia van spermatogenese zijn in de wetenschappelijke literatuur 3-12. We hierin toe te voegen aan dit lichaam van kennis door de presentatie van voorbeelden van deze protocollen met een begeleidende video demonstratie. Het protocol voor bereiding van levende testes monsters voor fase-contrast microscopie is gebaseerd op een eerder beschreven werkwijze 27. Het protocol voor formaldehyde fixatie en immunokleuring van testes is ook gebaseerd op een eerder beschreven werkwijze 28. De hierin beschreven methoden zijn gebruikt in vele studies van Drosophila spermatogenese (bijvoorbeeld de rollen van dynein beoordelen, een min-end gerichte microtubuli motor tijdens Drosophila spermatogenese).
In aanvulling op de basis protocollen worden suggesties voorzien varying de dissectie om zo te verrijken voor spermatogonia, spermatocyten of rijpe zaadcellen. Verschillende methoden voor het verwerken van de testes zodat cysten ofwel intact blijven of worden verstoord behoefte beschreven. Een voordeel in het gebruik van Drosophila testes als modelsysteem is dat vergeleken met Drosophila eicellen en embryo's, antilichamen en kleurstoffen kunnen gemakkelijk cellen binnendringen na de verspreiding van de testes en minder wasstappen vereist, dus kan protocollen relatief uitgevoerd korte tijd.
Hoewel de testes van wildtype vliegen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door hun gele kleur (in tegenstelling tot de naburige witte weefsels), de testes witte mutantvliegen zijn wit en daardoor kan soms worden verward met de darm. De meeste transgene stammen, die typisch op een witte achtergrond, ook witte testikels omdat de mini-witte gen in P-elementen niet bevordert pigment accumulatie in de testes. Wanneer Drosophila testes niet kan worden onderscheiden door de k…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Michael Anderson bedanken voor het vaststellen van de Lee lab deze geaccepteerde methoden voor het bestuderen van spermatogenese met deskundig advies van Karen Hales. H. Oda en Y. Akiyama-Oda royaal de γ-tubuline-GFP vliegen stock. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01 subsidie aan LAL (GM074044).
Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
Name of Equipment | Company | ||
Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
Eclipse 80i | Nikon | ||
Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
Axiophot | Carl Zeiss | ||
Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |