ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖(LPS)とパム3 CSK 4(PAM)を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。
CNS組織からミクログリアの単離は、ex vivoでミクログリア生物学を研究するために使用される強力な調査ツールです。本発明の方法は、ロータリーシェーカーで機械的攪拌により、新生児マウスの皮質からのミクログリアを単離するための手順を詳しく説明します。このミクログリアの分離法の利回り生体内で正常な、非病理状態で静止ミクログリアを示す形態学的および機能的な特徴を示す高純度皮質ミクログリア。この手順は、形態学的変化、NF-κB(P65)のp65サブユニットの核移行、および特徴的な前炎症性サイトカインの分泌の誘導によって示されるように、ミクログリア免疫表現および生化学的機能を維持し、腫瘍壊死因子α(TNF-α )、リポポリサッカライド(LPS)とパム3 CSK 4(PAM)の課題に依存する。そのため、本単離法は、静止してACTIの両方の免疫表現を保持するex vivoでの条件でミクログリア生物を調査する実験方法を提供し、ミクログリアをvated。
小膠細胞は、CNS実質の監視マクロファージは、成体哺乳類の脳の全細胞集団の約12%を構成する。小膠細胞は、卵黄嚢、骨髄前駆細胞に由来し、成体CNS 1-5内の異なる領域における細胞構築の細胞密度および形態が変化している。健康な成人の脳では、ミクログリアは、微細な、ダイナミックなプロセスと、小さな枝状または極性細胞である。周辺マクロファージの形態とは対照的に、ミクログリアは細胞非アクティブとして表示されることがあり、健康な脳では静止、ロープロファイル表現型を示すが、in vivoイメージング研究は、ミクログリアのプロセスを動的」を彷彿とさせる方法で、その微小環境を監視するために拡張し、撤回することを実証サンプリングと測量」6,7。
ミクログリアは、スイッチング、高度かつ差別的脳における環境的および病態生理学的な変化に応答する監視者からの状態 – 一般的に彼らの休止およびそれぞれ活性化した状態とみなさエフェクターへ。活性化のこのスイッチは、このような病原体関連分子パターン(PAMP)に反応し、Toll様受容体(TLR)、などの膜結合パターン認識受容体(PRR)の係合によって、すなわち細菌やウイルス由来のリポタンパク質を媒介することができます、核酸、及び炭水化物8-11。のPAMPのほかに、PRRは、また、細胞損傷12-16のようなCNS恒常性に摂動を表す危険/ダメージ関連分子パターン(DAMPS)として知られている無菌の、非病原性の分子に対するミクログリア活性化を誘導することが示されている。かつて従事し、PRRははミクログリア細胞の形態や遺伝子発現の変化をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを開始する、具体的には、活性化したミクログリアは、アメーバ様の表現型を適応させる細胞核にP65、NF-κBサブユニット(P65)を転位し、アップレギュレートのproductionような活性酸素種(ROS)16-24に沿っ腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、インターロイキン1-β(IL-1β)などの炎症誘発性サイトカインの分泌。 CNSの先天性免疫応答の積分が、これらの分泌された分子はまた、それによって、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの25-29疾患状態における神経変性を誘導し、悪化、ニューロンの酸化ストレスを増加させることが見出されている。
しかし、病的状態にあるミクログリア活性化のメカニズムは完全には理解されていない。ミクログリアの活性化の生体内での機能の多くは、培養中で要約することができるように、したがって、ミクログリアの単離は、これらの生物学的プロセスへの強力な調査ツールです。いくつかの方法がCNS組織30,31の酵素消化後のパーコール勾配を経由して分離を含むミクログリアを分離するための利用可能です。しかし、酵素消化を変更することができます細胞表面抗原の発現32を減少させることによって、細胞の免疫表現型、および本明細書に記載された方法よりも、動物あたりの細胞収量をもたらす。以前パーコール勾配収率3-5×10 5細胞30,33,34を経由して、全CNSから単離法を報告しながら、具体的には、7.5×10 5細胞の子犬皮質あたりの平均ミクログリア収率を報告している。現在の手順では、それによってミクログリア免疫表現性と機能性を維持し、彼らの低接着特性に基づいたミクログリアを分離することにより、消化酵素の使用を回避する。
(CX3CR1-GFP + / – )は、本研究では、新生児のヘテロ接合カイン-GFPに由来し混合グリア培養からミクログリア細胞の単離を記載し、ロータリーシェーカー、以前の延長線上の機械的攪拌を経由して、C57BL / 6マウスの皮質公表された方法の24,35。私たちは、ミクログリアの容易な視覚化のための前のマウス系統を利用単球特異的プロモーター36〜38 -これらのマウスは、内因性CX3CR1遺伝子座の制御下にGFPを発現する。このメソッドは、保存免疫表現ex vivoで細菌性リポ多糖(LPS)またはパム3 CSK 4、TLR4およびTLR1 / 2アゴニストでチャレンジしたときの形態学的変化、p65の核移行、およびTNF-αの分泌によって証明されるようにして高純度のミクログリアの文化を生産であった。
現在の手順では、新生マウスからの皮質ミクログリアの単離のための効果的な方法を提供しています。この手順では、蛍光イメージング、免疫細胞、およびELISAで測定し、1)保存ミクログリアの免疫表現と機能の2倍の利益を持っている、そして、2)ミクログリアの前に、他のグリア細胞(アストロサイトおよびoligodentrocytes)の存在下で成熟することができますグリア培養成熟期間中に重要?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIEHS R01ES014470(KMZ)によってサポートされていました。
Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
T-75 Flask | Corning | 430641 | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
Table of specific equipment | |||
Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |