Описаны подходы изображений мы используем, чтобы исследовать распределение и мобильность трансфектированных флуоресцентных белков резидентов в эндоплазматической сети (ER) с помощью конфокальной микроскопии живых клеток. Мы также ультраструктурно проанализировать влияние их экспрессии на архитектуру этого субклеточной отсека.
Липиды и белки в клетках эукариот постоянно обмениваются клеточных отсеках, хотя они сохраняют свою особую состав и функции, несмотря на интенсивный interorganelle молекулярной трафика. Методы, описанные в этой статье, являются мощным средством изучения белков и липидов мобильность и торговлей в естественных условиях и в их физиологической среде. Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip) широко используются методы проживанию ячейки изображения для изучения внутриклеточных торговлей через экзо-эндоцитотический пути, локализация образование белковых комплексов, и белка непрерывность между органелл или субкомпартментов в липидных микродоменов, все из которых могут наблюдаться при физиологических и патологических состояний. Ограничения этих подходов в основном за счет использования флуоресцентного слитых белков, и их потенциальные недостатки включают артефактом над-экспрессионов в клетках и возможность различий в складывания и локализации меченых и нативных белков. Наконец, как предел разрешения оптической микроскопии (около 200 нм) не позволяет исследование тонкой структуры ER или конкретных субкомпартментов которые могут происходят в клетках в условиях стресса (то есть гипоксия, введение лекарственного средства, по-выражение трансмембранного белки ER-резидентов) или при патологических состояниях, мы объединяем живых клеток изображений культивируемых трансфекции клеток с Ультраструктурные анализирует на основе просвечивающей электронной микроскопии.
Открытие зеленого флуоресцентного белка (GFP) и ее спектральных вариантов, и параллельного развития флуоресцентной микроскопии, открыли совершенно новые возможности для исследования поведения белка в клетках. Такие методы, как флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) и потери флуоресценции в фотообесцвечивания (Flip), которые являются возможным из-за внутренней емкости флуорофорами погасить их флуоресценции при интенсивном освещении, основаны на конфокальной микроскопии живых клеток и использование трансфецировали флуоресцентные белки слияния 1-3. Они широко используются для оценки не только локализацию белков, но и их мобильность и везикулярного транспорта, который может выявить важные подсказки, касающиеся их функции 4.
Уникальной особенностью эукариотических клеток является наличие внутриклеточных компартментах, имеющих определенные липидные и белковые композиции. Хотя органеллы физически изолированныйе изд, они должны взаимодействовать друг с другом и совместно молекулярные компоненты для поддержания клеточного гомеостаза. Секреторный путь гарантирует, что белки и липиды, синтезированные в ЭР достичь правильной конечного пункта назначения, в которых они осуществляют свои функции. Внутриклеточных органелл также может быть связано с тем, динамических контактных сайтов, которые позволяют молекулы (липиды), которые будут непосредственно обмениваются отсеков. Более того, многие белки в собранном в больших гетеромерных комплексов или связаны с конкретными видами липидных (липидного плоты / микродоменов), чтобы стать функционально активный или перевозиться к месту назначения. Все эти биологические аспекты значительно влиять на кинетические свойства белков, и поэтому может быть соответствующим образом исследованы с помощью методов, описанных ниже.
Наша группа широко используется FRAP и FLIP в сочетании с электронной микроскопии для изучения архитектуры ЭР и его различных субдомены. ER является первой станцией секреторного пути и играет ключевую роль в белков и липидов сортировки 5. Это очень динамичный органеллы которого отличается поддоменов отразить его много различных функций (то есть белков и липидов биосинтеза и торговлей людьми, белок складывающиеся, Са 2 + хранения и выпуска, и ксенобиотиков метаболизма). Однако, хотя они морфологически, пространственно и функционально различны, эти домены являются непрерывными друг с другом, и их относительное содержание может быть изменено в клетках при физиологических и патологических состояний. Самый известный и обычно пространственно разделенные домены ER являются ядерная оболочка, а гладкая и грубая ER, однако, мы и другие показали, что есть ER структуры с более сложной архитектурой и трехмерной организации в различных типах клеток и тканей в физиологических условиях, которые также могут быть вызваны с помощью стрессовые стимулы, такие как гипоксия, препаратавведения или более-выражение ER-резидентом трансмембранных белков 2,6 (и ссылки в ней).
Мы также недавно продемонстрировали наличие таких структур в клеточных моделей заболеваний человека 1,7. Возникнув от уложенных цистерн гладкого ЭР, им дали коллективное имя организованной гладкой эндоплазматической сети (Осер) в 2003 году 6, хотя они также известны как karmellae, ламелями, и кристаллоидным ER на основе их архитектуры, которая, как и их размер, может варьироваться. После того как клетки трансфицируют GFP, слитый с цитозольной области хвост-якорь (ТП) ER-резидентом белки (г EGFP-ER), слабо димеризации тенденция GFP в транс резко изменяет организацию и структуру ЭР. FRAP и FLIP эксперименты показали, что г EGFP-ER может свободно диффундировать в OSERs, и тот факт, что она движется от ретикулярной ER к Осер и наоборот </ EM> указывает, что агрегаты непрерывного с окружающей ретикулярной ER. Ультраструктурный анализ позволил нам сопоставить данные флуоресценции с подробным описанием Осер архитектуры и организации на наноуровне: Бюро входят всегда состоят из стопок в паре цистерн гладкого ЭР, но может иметь различные формы пространственной организации, такие, как регулярно устраиваются синусоидальной массивы или оборотов, или шестиугольные "кристаллоидные" трубчатые массивы. Эти перестройки приводят к кубических морфологии 8, которые, как они были найдены в клетках в физиологических условиях 9 и следующих напряжений, таких как гипоксия 10, медикаментозного лечения 11 и рак 9, могут иметь значительный потенциал в качестве ультраструктурных маркеров.
После этого первого демонстрации с использованием гибридных белков GFP, мы использовали эксперименты изображений для анализа распространения ER доменов в ответ на фармакологического лечения 12, Ассесс тенденция флуоресцентных белков в oligomerise в клетках 13, а также расследовать роль мутанта, ALS-связанного белка ТА в формировании внутриклеточных агрегатов ER происхождения, которые могут иметь отношение к его патогенности 1,8. Было высказано предположение, что формирование внутриклеточных агрегатов (что имеет место во многих нейродегенеративных заболеваний 14) может быть защитный механизм, предназначенный для предотвращения взаимодействия между токсичных мутантных белков и окружающих компонентов клетки 15.
Далее следует описание комбинации оптических и электронных методов микроскопии для исследования конструкций, чей С-концевой гидрофобные домены вставляются в мембрану ЭР, а также анализ их динамического поведения и последствий их чрезмерной экспрессии на домене ER архитектура в культивируемых клетках (см. рисунок 1 для блок-схему экспериментального протокола).
Протоколы и подходы визуализации, описанные в этой статье, были использованы для исследования распределения и мобильности трансфектированных TA флуоресцентных белков резидентов в ЭР живых клеток. Мы также проанализировали влияние над экспрессия этих белков на архитектуре этой субкл?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны Fondazione Филарете за его помощь и поддержку в публикации этой статьи. Мы также хотели бы поблагодарить Centro Europeo ди Nanomedicina для использования Tecnai G2 просвечивающего электронного микроскопа.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine 200 mM solution | Invitrogen | 25030-024 | |
jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
Glutaraldehyde Grade I | Sigma Aldrich | G5882 | |
Sodium Cacodylate Trihydrate | Sigma Aldrich | C0250 | |
Osmium Tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Science | 19150 | |
Uranyl Acetate dihydrate | Sigma Aldrich | 73943 | slightly radioactive |
Propylene Oxide | Sigma-Aldrich | 82320 | |
EPON embedding medium kit | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
Bench top centrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
CO2 Microscope Cage Incubation System | OkoLab | ||
Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
Diamond knife | Diatome | Ultra 45 ° | |
Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai G2 | |
GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
steel culture cell chamber for 24 mm coverslip | Bioscience Tools | CSC-25 | |
Electron Microscopy grids | Electron Microscopy Science | G300Cu |