Drosophila ama derinlemesine biyokimyasal analiz uygunluğu için, güçlü genetik manipülasyon ünlüdür. Burada sinek beyin ilgi herhangi bir proteinin etkileşim ortakları belirlemek için TAP-tabanlı bir prosedür mevcut. Bu prosedür, potansiyel araştırma yeni yollar yol açabilir.
Drosophila melanogaster (meyve sineği) kullanılarak yapılan genetik ekranlar biyolojik bilimler önceden sayısız kilometre taşı keşifler yaptık. Ancak genetik analiz edinilen bilgiye genişletmeyi amaçlayan biyokimyasal ekranlarının kullanımı sadece son zamanlarda araştırılmıştır. Burada protein kompleksi arındırmak için bir yöntem tarif erişkin sinek başkanlarının ilgi herhangi bir protein ile ilişkilendirir. Bu yöntem, in vivo nöron uçucu bir Tandem Affinity saflaştırma (TAP) etiketi ile ikame edilmiş bir yem proteini ifade etmek için Drosophila GAL4/UAS sistemi yararlanır ve daha sonra ilk kurulan benzer bir prosedür kullanılarak TAP arıtma iki tur uygular etkileşimli protein kompleksinin saflaştırılması için maya 1. Bu işlemin sonunda, çok sayıda protein kompleksleri oluşan bir karışım olan bir moleküler kimlikleri kütle spektrometresi ile belirlenebilir elde edilir. Aday proteinlerin Doğrulama r yararlanacakesource ve sinekler kaybı fonksiyon-çalışmaları gerçekleştirme kolaylığı. Benzer yaklaşımlar, diğer uçucu dokulara uygulanabilir. Biz sinek model sistemde genetik manipülasyonlar ve bu proteomik yaklaşımın birleşimi nörobiyoloji alanında ve ötesinde temel sorunlarla mücadele için muazzam bir potansiyele sahip olduğuna inanıyoruz.
Belirli bir biyolojik süreç aracılık moleküler yollar veya ağları tanımlama biyomedikal araştırmanın nihai hedeflerinden biridir. Fly genetikçiler, özellikle paralel olarak, birlikte çalışmak, ya yukarı ya da ilgi bir genin aşağı faktörleri tespit etmek, genetik ekranlar (arttırıcı ve baskılayıcı ekranlar) niteleyici, ileri genetik temeline bağlıydı var. Ancak, ileriye genetik ekranlar çoğu kez mutasyona uğradığı zaman, kimin fonksiyon kaybı sadece puan zor ince kusurlarına neden fonksiyonel fazlalık ve tazminat ile erken gelişim aşamalarında öldürücülüğü, ya da genlerin neden olan, gerekli genleri tanımlamak için başarısız. Bu zorluğun üstesinden gelmek için bir yolu direkt protein-protein etkileşimleri için taranmasıdır. Daha fazla on yıl için, vb maya iki-hibrid, faj gösterimi, kimyasal olarak çapraz bağlanma, Co-IP, Tandem Affinity saflaştırılması (TAP), dahil olmak üzere, biyokimyasal yöntemler, giderek artan bir listesi. proteini incelemek için kullanılmıştır-Protein etkileşimleri. Bu yaklaşımların her biri güçlü ve duyarlılık ve özgüllük açısından zayıflıkları kendi belirledi. Bunlar arasında, TAP yöntem olup, yakın fizyolojik koşullar altında fiziksel etkileşimi tespiti sağlar özgüllük ve tutarlılık 2 koruyan ve 3,4 analiz, yüksek verim için genişletmek için de içerir.
TAP yöntem aslında Rigautand arkadaşları 1 tarafından maya geliştirilmiştir. Bu yöntemde, ilgi konusu bir protein, TAP etiketi ile ifade edilir. Bir Protein IgG bağlanan bir etki ve Kalmadulin bağlanma alanı: TAP etiketi iki bağımsız afinite bağlanma alanlarını barındırır. Bu iki etki, bir TEV (Tütün Etch Virüsü) yarılma sitesi ile ayrılır. Afinite arındırmalardan bağımsız iki mermi yeterince spesifik olmayan bağlamaları azaltmak ve belirli bağlamaları 1 zenginleştirmek için böyle bir kombinasyon sağlar. Bu örnek için, TAP yöntem çok güçlü bir metoksidışsal proteini aşırı ifade, normal olarak endojen muadili ile kompleks yapma proteinler ile ilişkilendirmek için daha eğilimli hale getirebilir, ancak, belirli bir proteinin in vivo etkileşim içinde tespit d. Gelişimi bu yana, TAP yöntem, hücre-kültür temelli sistemler 5,6 ve in vivo model sistemlerinde 6-9 de dahil olmak üzere pek çok diğer sistemler de uygulanmıştır. Burada Drosophila TAP yöntemin adaptasyonu açıklar. İlk olarak, ilgi konusu genin N-veya C-terminali ya da üzere TAP etiketinin klonlama ve birleşmeyi kolaylaştırmak için pUAST-NTAP ve pUAST-CTAP vektörleri üretir. UAS-TAP-etiketli transgen daha sonra bir nöronal GAL4 sürücü 10 kontrolünde sinir sisteminde ifade edilir. Daha sonra, yetişkin sinek kafaları çok sayıda nöral hücre içeriği yüksek olan ve büyüklüğü farklılıklara göre dondurucu sonra diğer vücut parçaları ayırmak kolay olan, toplanacaktır. Yetişkin kafaları homojenize ve temizlenir b vardıry ardışık santrüfüj ve süpernatan, aşağıda tarif edilen bir prosedüre TAP tabidir.
Tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi, iki bağımsız afinite saflaştırma adımları üzerinden izole edilmesini ve protein kompleksleri zenginleştirme sağlayan bir çift saflaştırma protokolü bulunmaktadır. TAP etiketinin tasarımı bu protokolde yer ne sınırlı değildir tampon şartları buna göre ayarlanır ise, başka bir protein bağlayıcı etki ve motifleri de geçerlidir. Diğer TAP etiketlerin iyi bir örnek GS-TAP etiketi, bir G-proteinine ait bir arada ve kültürlenmiş memeli hücre çizg…
The authors have nothing to disclose.
Biz bize maya TAP plasmidlerini göndermek için EUROSARF teşekkür ederim. Biz de Ryan Labadens gelen editoryal yardım için minnettarız. Bu çalışma CW bir NIH / NINDS hibe (R01NS070962) tarafından desteklenen
U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |