Derivate dal midollo osseo macrofagi Production
Summary
I macrofagi sono da tempo riconosciuti come una componente critica delle risposte immunitarie innate e adattative. La recente esplosione di conoscenze relative agli aspetti evolutivi, genetici e biochimici dell'interazione tra macrofagi e microbi ha rinnovato l'attenzione scientifica ai macrofagi. Questo articolo descrive un metodo per differenziare macrofagi da midollo osseo di topo.
Abstract
I macrofagi sono componenti critici delle risposte immunitarie innate e adattative, e sono la prima linea di difesa contro gli invasori stranieri a causa delle loro potenti attività microbicida. I macrofagi sono ampiamente distribuiti in tutto il corpo e sono presenti negli organi linfoidi, fegato, polmoni, tratto gastrointestinale, sistema nervoso centrale, le ossa e la pelle. A causa della loro ripartizione, partecipano in un'ampia gamma di processi fisiologici e patologici. I macrofagi sono cellule altamente versatile in grado di riconoscere alterazioni microambientali e per mantenere l'omeostasi tissutale. Numerosi agenti patogeni si sono evoluti meccanismi per utilizzare i macrofagi come cavalli di Troia per sopravvivere, replicarsi in, e infettare sia gli esseri umani e gli animali e per diffondere in tutto il corpo. La recente esplosione di interesse per gli aspetti evolutivi, genetici e biochimici delle interazioni ospite-patogeno ha rinnovato l'attenzione scientifiche per quanto riguarda i macrofagi. Qui, descriviamo unprocedura per isolare e coltivare macrofagi da midollo osseo murino che fornirà un gran numero di macrofagi per studiare le interazioni ospite-patogeno nonché altri processi.
Introduction
Un aspetto significativo della funzione dei macrofagi è il loro ruolo nella immunità innata e adattativa. A causa della loro capacità di fagocitare particelle inerti, batteri o parassiti, i macrofagi sono una prima linea di difesa contro gli invasori stranieri. Una volta interiorizzato, i microbi sono degradati all'interno phagolysosomes. I macrofagi anche inviare segnali di reclutamento per e gli antigeni presenti di altre cellule immunitarie come i linfociti T. I macrofagi sono derivati da monociti. Monociti sorgono nel midollo osseo da cellule staminali mieloidi e migrano sangue periferico e vari tessuti dove si differenziano in macrofagi. Si stima che un topo adulto sana contiene circa 10 8 macrofagi che sono distribuiti in tutto il corpo in vari organi e tessuti (Tabella 1) 1,2. I macrofagi mostrano grande fenotipica e diversità funzionale a causa della loro capacità di adattarsi al loro 3,4 microambiente. Il MACROP più importantestruttura hage è la loro attività microbicida, che è definito dalla capacità di fagocitare i microbi e distruggerli. La risposta fagocitaria è definita mediante l'attivazione di reti di segnalazione complesse che vengono stimolati dal contatto microbica, quindi, macrofagi modulano l'espressione genica in modo appropriato in risposta a diversi stimoli. Dopo la fagocitosi, i microbi vengono eliminati in una struttura chiamata fagolisosoma, tuttavia, molti microbi patogeni hanno sviluppato strategie per sovvertire la funzione microbicida dei macrofagi 5. La diversità dei meccanismi di sovversione che sono utilizzati da diverse specie microbiche è un testamento alla complessità del processo di fagocitosi 6 e fagolisosoma biogenesi. Le malattie infettive sono i principali problemi di salute umana, e numerosi meccanismi e molecole partecipano alle attività antimicrobiche macrofagi. Inoltre, gli obiettivi delle proprietà microbicida che vengono dirottati da microbi rimangono sconosciute, quindi, vi è una notificaxplosion di interesse per gli aspetti evolutivi, genetici e biochimici delle interazioni ospite-patogeno che ha rinnovato l'attenzione scientifiche per quanto riguarda i macrofagi. Attualmente, la maggior parte della ricerca nel campo viene fatta su macrofagi linee cellulari, che differiscono da macrofagi primari dell'attività fagocitaria, la produzione di citochine e la regolazione del burst ossidativo. Inoltre, sono meno adatti per microscopia. Per studiare l'interazione macrofagi-agenti patogeni si consiglia di utilizzare i macrofagi primari, come il midollo osseo macrofagi derivati (BMDMs), che presentano caratteristiche più fisiologiche. Inoltre, è possibile lavorare su BMDMs geneticamente modificati, perché questi macrofagi possono essere isolati direttamente da topi transgenici e, con la disponibilità di nuove tecnologie come transfezione lentivirale, il loro profilo di espressione genica può essere alterato da sovraespressione del gene o RNA interferenza. Qui, si descrive un procedimento per differenziare murino osso mfreccia in macrofagi che forniranno un gran numero di macrofagi in 7 giorni per varie analisi funzionale, come la proteomica 7, trascrittomica 8, traffico intracellulare studia 9, studi dinamici 10, schermi genetiche (RNAi) e lo screening di stupefacenti 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto dettaglia un metodo per produrre un gran numero di BMDMs. BMDM sono cellule primarie e hanno la funzione e le proprietà dei macrofagi differenziati da monociti biologico perché ci sono maturo, in contrasto con linee cellulari di macrofagi, che sono immaturi. BMDMs possono essere utilizzati per lo screening genetico (RNAi), screening di farmaci, studi funzionali, studi di interazione ospite-patogeno e molte altre aree di indagine.
La procedura qui presentata è m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal CNRS (PICS 2012-2014 a EG), e da una sovvenzione della Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 a Giovanna Mottola). Filippo Conti è un collega della Cooperazione Scientifica Fondazione'' Infectiopole Sud''. Nicola Boucherit è un collega del Ministero francese per la Ricerca e la Tecnologia. Le fonti di finanziamento hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati, analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
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