Summary

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

Published: September 19, 2013
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Summary

Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.

Abstract

En este protocolo se proporciona un método para aislar células dendríticas (DC) y células epiteliales (TEC) de la timo humano. DC y TEC son la principal célula presentadora de antígeno (APC) tipos que se encuentran en un timo normal y está bien establecido que desempeñan papeles distintos durante la selección tímica. Estas células se localizan en distintos microambientes en el timo y cada tipo de APC constituye sólo una población menor de células. Para entender mejor la biología de estos tipos de células, la caracterización de estas poblaciones de células es altamente deseable, pero debido a su baja frecuencia, el aislamiento de cualquiera de estos tipos de células requiere un procedimiento eficaz y reproducible. Este protocolo detalla un método para obtener células adecuadas para la caracterización de diversas propiedades celulares. Tejido tímico se interrumpe mecánicamente y después de diferentes pasos de la digestión enzimática, la suspensión de células resultante se enriquece usando una etapa de centrifugación de densidad de Percoll. Para el aislamiento de CC mieloide (CD11c <sup> +), las células de la fracción de baja densidad (LDF) se inmunoselecciona por clasificación celular magnética. Enriquecimiento de las poblaciones de TEC (MTEC, ctec) se logra por el agotamiento de las células hematopoyéticas (CD45 hi) de la fracción de células de Percoll de baja densidad que permite su posterior aislamiento a través de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando marcadores de células específicos. Las células aisladas se pueden utilizar para diferentes aplicaciones posteriores.

Introduction

El timo es el órgano en el que se produce el desarrollo de células T. Su tamaño relativo y absoluto disminuye con la edad cuando se convierte sustituido sucesivamente por la grasa a pesar de la actividad del timo todavía se puede detectar en la vejez. Su importancia para la respuesta inmune se demostró a principios del decenio de 1960 1.

El repertorio de células T se forma a través de la interacción de receptores de células T con complejos de péptido-MHC en diferentes tipos de timo de APC, que proporcionan señales de supervivencia o muerte para el desarrollo de las células T, lo que resulta en un repertorio de células T funcionales y en gran medida auto-tolerante 2.

Aproximadamente el 98% de las células en el timo humano están desarrollando células T que se hace referencia como timocitos. El 2% restante consiste de un número de diferentes tipos de células, incluyendo una variedad de TEC (cortical, medular, subcapsular), mieloide y plasmocitoide DC (MDC, PDC), macrófagos, células B, células T re-circulantes maduras, granulocitos, Fibroblasts, células endoteliales y células epiteliales muy raras con un fenotipo de expresión se asemeja a la de las células de otros tejidos tales como músculo, neuronas y epitelio respiratorio (Figura 1). De éstos, TEC y DC son los principales tipos de APC se encuentran en un timo normal. En los últimos años, la purificación de estos tipos de APC para la cultura y el perfil molecular ha ganado cada vez más interés. Debido a su baja frecuencia, el aislamiento de cualquiera de estos tipos de células para el análisis detallado requiere un procedimiento eficaz, reproducible y rentable. El método que aquí se presenta es una modificación de los estudios publicados previamente 3,4.

Al igual que con cualquier otro tejido, la extracción de células del timo se puede lograr por enzimáticamente la desagregación de la célula-célula y las redes de interacción célula-matriz, con el fin de obtener una suspensión de células individuales. Hay ciertos parámetros como la buena eficiencia de disociación, rendimiento celular, la viabilidad celular y la retención de s célulasmarcadores urface que son cruciales y necesitan ser optimizado para el aislamiento con éxito de estas poblaciones celulares raras.

En este protocolo, el aislamiento de la CC y subconjuntos TEC se realiza haciendo una suspensión de una sola célula del tejido por rotura mecánica y digestión enzimática. Utilizamos colagenasa A de Clostridium histolyticum, que tiene una relación equilibrada de las diferentes actividades de la enzima, para romper el colágeno natural que mantiene el tejido juntos. DNasa I se incluye en la solución de la enzima para reducir la agregación celular debido a ADN libre de células muertas (timocitos son muy sensibles). Nosotros también ofrecemos un enfoque alternativo para la digestión enzimática del tejido típico que implica el tratamiento de tejidos mecánica y enzimática asistida por un disociador tejido. La suspensión de células individuales se somete entonces a una sola centrifugación de densidad de Percoll para el enriquecimiento de la fracción de baja densidad (LDF) de las células. A partir de esta fracción de células, DC puede ser aislado por tinción fo marcadores CC-superficie (es decir, CD11c +) y mediante separación magnética o células activadas por fluorescencia (FACS). A diferencia de las células linfoides que comprenden la gran mayoría de las células en el timo, TCE no expresan CD45 en niveles altos, pero son positivos para la molécula de adhesión celular epitelial EpCAM. ctec se puede distinguir de TCE medular por la expresión de un antígeno aún sin definir reconocido por el CDR-2 (dendrítica de reticulocitos-2 cortical) de anticuerpos 4,5 y algo menor expresión de EpCAM. El diferencial de la co-expresión de EpCAM y CDR2 permite el aislamiento eficiente de estos subconjuntos TEC a través de células de alta velocidad de clasificación 6.

El protocolo que se presenta aquí está optimizado para el tejido del timo humano. La duración del procedimiento depende de la cantidad de tejido y la capacidad del experimentador, así como la velocidad del clasificador de células, si se utiliza la separación FACS. Normalmente, el protocolo para el aislamiento de CC puede ser completado dentro de 5HR -6 y para el aislamiento de TCE en 8-10 horas. El aislamiento de la CC y subconjuntos TEC a partir de tejido del timo es sensible al tiempo. Cuanto más rápido el procedimiento de aislamiento, mejor la condición de las células. Por último, las células aisladas se pueden utilizar para investigaciones posteriores como estudios comparativos de ARNm y la expresión de proteínas, los experimentos de PCR, aislamiento de las proteínas, el perfil molecular (es decir, transcriptómica, análisis de micro ARN), así como el cultivo de células 6.

Declaración de Ética

Con el fin de ser capaz de trabajar con el tejido del timo humana que el investigador tiene que obtener la aprobación del comité de ética local o las autoridades responsables, así como un consentimiento informado por escrito del donante (o por lo general sus padres, ya que el tejido se obtiene generalmente de menor de edad los niños). Por otra parte, todos los tejidos humanos deben ser manejados como se deben tomar medidas potencialmente infecciosos y apropiadas, tales como trabajar con guantes, etc.

Protocol

1. Preparación de herramientas, soluciones de enzimas y tampones Lleve a cabo los siguientes pasos de preparación antes de comenzar el protocolo. Instrumentos Limpio, seco y autoclave las siguientes herramientas y mantenerlos en envases estériles hasta su uso. Tijeras afiladas pequeños con puntas curvo o recto para cortar el tejido del timo. Pinzas curvas pequeñas con puntas estriadas para la manipulación de los tejidos. 50 ml de la Oak Ridge Tubos …

Representative Results

Como material de partida en este protocolo se utiliza tejido del timo retirado de los niños sometidos a cirugía cardiovascular correctiva (Departamento de Cirugía Torácica y Cardiovascular, Clínica Universitaria de Tubinga) obtenidas después de consentimiento informado y bajo las directrices del centro. Este material de desecho puede variar mucho en tamaño de 2 a 30 g o más. El número de MDC y subconjuntos TEC (ctec y MTEC) que se obtienen dependen del tamaño, así como la edad de la muestra de tejido de timo …

Discussion

El protocolo aquí descrito es una modificación del protocolo publicado por Gotter et al 4. Los pasos críticos en el protocolo son la condición y la preparación inicial del tejido, así como la separación por densidad de Percoll. Recomendamos para procesar el tejido tan pronto como sea posible después de su recolección. Es importante trabajar rápido pero bien al limpiar y cortar el tejido. Durante el lavado de timocitos se describe en el paso 2.3, es fundamental encontrar el equilibrio adecua…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muy agradecidos a los cirujanos del Departamento de Cirugía Torácica y Cardiovascular, Clínica Universitaria de Tubinga por proporcionarnos las muestras de timo y Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Alemania) para proporcionar el anticuerpo CDR2. También nos gustaría dar las gracias a Hans-Jörg Bühring y Sabrina Grimm de las instalaciones de clasificación (Universidad de Tubinga). Este trabajo fue apoyado por el SFB 685 y la Fundación Hertie.

Materials

Reagents and Materials
RPMI 1640 PAA E15-842
Dulbecco's PBS PAA H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold PAA A15-151
Bovine Serum Albumin PAA K41-001
Collagenase A Roche 10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic Roche 10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS PAA L11-001 stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit Molecular Probes A-10235
anti-human CDR2 (purified) Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue) Biolegend 304022
anti-human EpCAM (APC) Miltenyi Biotec 130-091-254
anti-human CD11c (PE) Miltenyi Biotec 130-092-411
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-801
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml) GE Healthcare, Life Sciences 17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) GIBCO 10977-035
Gamunex 10% Tajecris-Biotherapeutics G120052 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter Millex GS SLGS033SS Syringe driven
Stericup filter unit Millipore SCGPU05RE Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes Nalgene 3118-0050 50 ml
50 ml PP conical tubes Becton Dickinson 352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes Becton Dickinson 352058 FACS stainings
Cell strainer 70 μm Becton Dickinson 352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor) Kendro
Rotator REAX 2 Heidolph
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093 235 tissue dissociator

References

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Cite This Article
Stoeckle, C., Rota, I. A., Tolosa, E., Haller, C., Melms, A., Adamopoulou, E. Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus. J. Vis. Exp. (79), e50951, doi:10.3791/50951 (2013).

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