In vitro Investigación de la bomba de salida MexAB De Pseudomonas aeruginosa

Summary

Se presenta un protocolo para la investigación in vitro de bombas de expulsión de Pseudomonas aeruginosa. Este protocolo permite la generación de un gradiente de protones robusta, reversible y ajustable dentro de la membrana de los liposomas y por lo tanto debe ser adaptable a cualquier proteína de la membrana activado por la fuerza protomotive.

Abstract

Hay una necesidad científica emergente de herramientas confiables para el monitoreo de las proteínas de transporte de membrana. Se presenta una metodología que conduce a la reconstitución de las bombas de eflujo de la bacterias Gram-negativos Pseudomonas aeruginosa en un entorno biomimético que permite una investigación precisa de su actividad de transporte. Tres requisitos previos se cumplen: la compartimentación en un entorno lipídico, el uso de un índice relevante para el transporte, y la generación de un gradiente de protones. El transportador de proteína de la membrana se reconstituye en liposomas junto con bacteriorhodopsin, una bomba de protones activada por la luz que genera un gradiente de protones que es robusta y reversible y ajustable. La actividad de la proteína se deduce de las variaciones del pH que ocurren dentro del liposoma, usando pyranin, una sonda fluorescente dependiente del pH. Se describe un procedimiento paso a paso en el que la purificación de proteínas de membrana, la formación del liposoma, la reconstitución de proteínas, y el transporte de unanálisis se abordan. A pesar de que se han diseñado específicamente para un transportador de RND, los métodos descritos potencialmente podrían ser adaptados para su uso con cualquier otro transportador de proteína de la membrana activado por un gradiente de protones.

Introduction

Proteínas integrales de membrana representan hasta el 30% de los genes codificados en genomas eucariotas. Comparten papeles fundamentales como el mantenimiento de la puerta (receptores), el transporte de nutrientes, iones o compuestos nocivos (transportistas) o el mantenimiento de la permeabilidad a través de bicapas de membrana (canales) entre todas las células vivas ^1. Bombas de eflujo tener un papel central en la resistencia contra la terapia con antibióticos ^2. En las bacterias Gram-negativas Pseudomonas aeruginosa, que está protegido por una membrana externa, transportadores de salida están organizados como sistemas tripartitos donde MexB, la bomba de salida situada en la membrana interna, que trabaja en conjunto con MexA, una proteína periplásmica y OprM, un canal de membrana externa. La proteína de la membrana citoplasmática interna actúa como una bomba dependiente de energía con amplia especificidad de sustrato. La proteína de membrana externa actúa como una porina mientras que la tercera se encuentra en el espacio periplásmico y se piensa para estabilizar todo el complejo <shasta> 3. A continuación, nos centramos en el diseño de un ensayo funcional para el montaje MexA MexB.

La información estructural se ha acumulado en los últimos 5 años, gracias a la determinación de rayos X de la AcrB proteína homóloga a partir de Escherichia coli ^4-7. Aunque es claramente importante para acoplar dicha información con datos dinámicos y cinéticos, el diseño de un ensayo funcional para este transportador es un verdadero reto ^8. De hecho, las proteínas de la membrana se debe mantener en un ambiente membranosa y un compartimiento cerrado deben mantenerse durante un transporte vectorial del sustrato que se ha logrado.

La reconstitución de proteínas de membrana en proteoliposomas ha sido ampliamente presentado y revisado (véase Rigaud y Levy ^9). Dichos protocolos permiten la monitorización de la actividad de proteínas de membrana, por ejemplo siguiendo los sustratos a través de la membrana del liposoma. En este caso limitaciones surgen a partir de la unaISPONIBILIDAD de sustratos titulable (fluorescente, radioactivo, etc.) y del hecho de que muy a menudo estos sustratos son hidrófobos y tienen una tendencia a cruzar membranas independientemente de la presencia del transportador. Como alternativa, se puede seguir las variaciones espectroscópicas de un colorante de informes sensible a los cambios químicos que ocurren como consecuencia de transporte. Como se indicó anteriormente, los protones energizan el transporte a través de MexB. Por lo tanto, una opción relevante es monitorear las variaciones espectroscópicas de un colorante sensible al pH de informes para seguir las variaciones del pH debido al transporte de sustrato de protones impulsados. La elección de un colorante fluorescente evita cualquier efecto de artefactos debido a la naturaleza hidrofóbica del sustrato.

Una dificultad adicional es la generación de un gradiente de protones. Varios protocolos se pueden encontrar en la literatura. Entre ellos, el uso de la técnica de valinomicina es generalizada pero hemos demostrado que es tedioso para llevar a cabo ^10-11. Además, esno reproducible y no es reversible. Hemos recurrido a la utilización de bacteriorhodopsin (BR), una bomba de protones activada por la luz de Halobacter Salinarium, un archaeon halófilas gramnegativos marina obligado aeróbico. Esta proteína se coreconstituted en liposomas con MexB y, tras la iluminación, BR bombas de protones dentro de los liposomas y por lo tanto crea la ΔpH (ácida en el interior) que necesita la proteína para transportar el sustrato ^12-13.

Protocol

1. Producción y Purificación de Proteínas MexA, MexB de Pseudomonas aeruginosa Transformar los plásmidos que albergan los genes MexA y MexB en una E. coli cepa de producción (por ejemplo, C43 DE3). Placa en LB agar suplementado con el antibiótico apropiado. Elija una sola colonia para inocular un cultivo previo de O / N. A la mañana siguiente, inocular el precultivo en 1 l de LB y crecer a 37 ° C con agitación (240 rpm). Una vez que las células han alcanzado la fase exponencial (OD 600 = 0,6-0,8) inducen con IPTG 1 mM. Realizar la inducción durante 2-3 horas a 30 º C bajo agitación. Centrifugar las células (9.000 xg durante 20 min) y se resuspende en 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM. Interrumpir las células usando una prensa francesa (10.000 psi, 4 pasadas). Desechar las células sin romper y los cuerpos de inclusión por centrifugación a 9000 xg durante 20 min. Membranas de pellets de 1 hora a 100.000 xg yresuspend cada sedimento en 30 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM. Determinar la concentración total de proteínas de membrana utilizando el ensayo colorimétrico BCA y solubilizar las membranas o / n con 2% de dodecil maltósido (DDM) en un volumen final determinado de modo que el detergente: proteína es 1:1,5 (W / W). Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 1 hora para descartar material no solubilizado y agregada. Incubar el sobrenadante durante 2 horas a 4 ° C con una resina de níquel (purificación MexA) o una resina de cobalto (purificación MexB) equilibrada con Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Vierta la resina en una columna vacía. Recoger el flujo a través. Lavar la resina con 50 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 20% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM, a continuación, con 25 ml de Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerol 5% (w / v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Eluir la protein con 20 ml de Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol al 5% (w / v), imidazol 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% de DDM. Se concentra la proteína con un dispositivo de ultrafiltración a 3 ml y la carga sobre una columna de desalación equilibrada con un tampón de imidazol-libre. Justo antes de la reconstitución (ver más adelante), las proteínas solubilizadas ultracentrifugar (100.000 xg durante 20 minutos) para deshacerse de los lípidos y las proteínas no solubilizada. A continuación concentrar la proteína de nuevo a 0,3 ml. Bacteriorhodopsin de Halobacter Salinarium Se cultivan las células Salinarium Halobacter bajo iluminación a 37 ° C durante 10 días en un medio de crecimiento líquido que contiene NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, extracto de levadura 5 g / l, y la peptona 5 g / L. Interrumpir las células mediante diálisis frente a agua desionizada. Purificar la membrana púrpura en un 30-40% (w / v) de sacarosa gradiente (100.000 xg durante 17 horas). Solubilizar la suspensión de membrana con 2% octylglucósido durante 24 horas a 37 º C (volumen para la solubilización con el fin de resuspender la membrana a una 02:01 (w / w) de detergente: proteína). Calcule la concentración de BR solubilizado utilizando ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Justo antes de la reconstitución (ver abajo), ultracentrifugar la BR solubilizado (100.000 xg durante 20 minutos) para deshacerse de los lípidos y las proteínas no solubilizada. Nota: Las membranas nativas se enriquecen de forma natural en BR así que no hay más purificación. 2. Preparación de proteoliposomas Formación de liposomas: Poner 400 l de DOPC disueltos en cloroformo (25 mg / ml) en un vaso de precipitados de vidrio y añadir 1,5 mg de colesterol almacenado como un polvo. Seque justo antes de la manipulación bajo una corriente de nitrógeno o vacío durante al menos 1 hora en un vaso de vidrio. El DOPC: relación molar de colesterol es 3,3:1. Después de que se hayan secado, hidratar los lípidos con 1 ml de HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl2 2 mM, 2 mM piranina. La suspensión debería aparecer turbia en esta etapa. Calentar la solución durante 10 min a 37 ° C. Someter a ultrasonidos durante 10 minutos a 40 W con 30 pulsos seg, 30 ciclos de pausa seg a TA. La suspensión debe ser transparente en esta etapa. Para obtener una población de liposomas monodisperso, realizar dos ciclos de extrusión y para cada ciclo, pasar la suspensión de liposomas a través del filtro al menos 11x. Para el primer ciclo, utilizar un tamaño de poro de la membrana de 200 nm y para el segundo ciclo, utilizar un tamaño de poro de la membrana de 100 nm. Mediciones de dispersión dinámica de la luz se pueden realizar en este paso para comprobar la homogeneidad de la suspensión. Incorporación de proteínas Principio: Las proteínas de membrana se pueden reconstituir en liposomas gracias al efecto solubilizante de los detergentes. Liposomas solubilizados-detergente se incuban con la proteína de membrana solubilizada con detergente y la formación de la proteoliposomes se desencadena por la rápida eliminación del detergente con perlas de poliestireno 9. Añadir 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) y se incuba O / N a 4 ° C (la temperatura de solubilización se puede adaptar a la proteína en estudio). Añadir la proteína solubilizada con detergente (BR, MexB y MexA) a los liposomas solubilizados e incubar 15 min a 4 ° C. Añadir las proteínas de la suspensión de liposomas solubilizados en las siguientes proporciones (W / W): lípidos / MexB = 20, MexB / MexA = 2,5, y los lípidos / BR = 30. Añadir perlas de poliestireno en un 30:1 cuentas: cociente detergente (w / w, teniendo en cuenta el peso total del detergente, incluyendo detergente añadido con las proteínas purificadas) e incubar 5 horas, en la oscuridad (por la BR) a TA en una suave agitación. Antes de este procedimiento, activar los BioBeads con metanol y la incubación etanol y ampliamente lavar con agua. Se purifica la proteína proteoliposomas y sustratos libres utilizando un PD-10columna de desalación equilibrada con HEPES 25 mM pH 7, K 2 SO 4 100 mM y MgCl 2 2 mM. Guarde las proteoliposomas a 18 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2-3 semanas. Evaluación de la eficacia de la reconstitución en gradiente de sacarosa. Para comprobar que tanto el MexB y la BR han reconstituido en liposomas, purificar la suspensión proteoliposoma en un gradiente discontinuo de sacarosa. Asentarse suavemente los proteoliposomas en un gradiente de cinco capas de sacarosa (60%, 20%, 10%, 5%, y 2,5%, w / v). Ultracentrífuga durante 17 horas a 100.000 xg (con aceleración mínima y deceleración). Recoger cuidadosamente las diversas fracciones de gradiente (especialmente las interfaces entre cada capa de sacarosa) y analizarlas en SDS-PAGE (10%) mediante la tinción de Coomassie o transferencia Western. Agregados de proteínas se encuentran en la parte inferior del tubo, mientras que las proteínas no incorporado, solubilizada con detergente se encuentran en la parte superior deel tubo. Proteoliposomas y liposomas se encuentran en las interfaces de sacarosa que corresponden a su densidad intrínseca. Liposomas vacíos se recuperaron más arriba en el gradiente de las proteoliposomas. 3. La fluorescencia de medición Realizar mediciones de fluorescencia a 25,0 º C usando un espectrofluorómetro permitiendo mediciones de doble longitud de onda (lámpara de Xe, 150 W). Períodos de iluminación alternativos (para activar BR con longitudes de onda de excitación / emisión de 550 nm / 550 nm) y mediciones de fluorescencia con las longitudes de onda de excitación / emisión de 455 nm / 509 nm durante 2 segundos para medir la fluorescencia de la piranina. Ajuste los anchos de banda de excitación y emisión de 5 nm. Llevar a cabo las mediciones en presencia de 50 nM valinomicina para evitar la formación de un potencial de membrana ΔΨ inversa. Nota: De hecho, debido a que el BR bombea protones, hay más cargas positivas en el interior del liposoma que en el exterior. Esta cargagradiente se puede descartar el uso de valinomicina, que es un ionóforo selectivo de K +. Una vez añadido a la valinomicina liposomas suspensión, como una molécula hidrofóbica, se inserte en la membrana del liposoma, transportar pasivamente K +, y por lo tanto disipar el potencial de membrana ΔΨ.

Representative Results

El ensayo consiste en el seguimiento de fluorescencia piranina como una función de tiempo, mientras se genera un gradiente de protones. Para ese fin, las muestras se sometan a la iluminación (de bombeo de protones, por tanto, por la BR se activa) y luego a la medición de fluorescencia utilizando la excitación y emisión de longitudes de onda de piranina (λ ex = 455 nm y λ em = 509 nm). La figura 1 muestra un control representante obtenidos con el ensayo, en ausencia de MexA / MexB, la verificación de que el gradiente de protones generado por la BR es reversible. Después de un ciclo de la acidificación, proteoliposomas se mantienen en la oscuridad durante 45 min para que la BR para detener el bombeo de protones (protones se difunden lentamente y de forma pasiva a través de las bicapas de lípidos después de su gradiente de concentración). Después de este tiempo de recuperación, la activación de la BR es posible, simplemente mediante la iluminación de la misma suspensión de nuevo. Figura 2corresponde a una medición real de transporte. Un control negativo con proteína liposomas gratuitas muestra que, como era de esperar, el pH es constante tras la iluminación (Figuras 2A y 2B, círculos de color naranja). Sin embargo, proteoliposomas que contienen BR en sus membranas no la bomba de protones, por lo tanto el pH dentro de las disminuciones de liposomas y un gradiente estable se construye (Figuras 2A y 2B, casillas de color púrpura). Triángulos grises y diamantes rojos (Figura 2A) representan pH en el interior de proteoliposomas que contienen BR y MexB, en presencia o en ausencia de Hoechst 33342, respectivamente. Observamos una actividad de sustrato independiente donde el gradiente de protones es sólo parcialmente disipada por MexB contra-transporte. Atribuimos esta observación a una actividad basal de MexB. Con el fin de probar el efecto de MexA sobre la actividad de MexB, MexA se añadió a la reconstitución, primero en la ausencia de cualquier sustrato ( <strong> Figura 2B, los diamantes azules). Una vez más, el gradiente de protones generado por la BR está sólo parcialmente disipada. La medición real de transporte se realiza en la misma muestra. De antemano, el gradiente de protones debe ser reinicializado y el sustrato se debe añadir en la suspensión con el fin de llegar a su sitio de unión en la proteína. Para este fin, la suspensión se incuba en la oscuridad en la presencia del substrato durante 45 min. Después de la iluminación posterior, se puede ver que el gradiente de protones generado por la BR está ahora totalmente disipada por MexAB (Figura 2B, triángulos verdes), como consecuencia del transporte de sustrato por la bomba. . Figura 1 Reversibilidad del gradiente de protones construido por la iluminación BR: piranina FLuorescencia de proteoliposomas BR medidos como una función de tiempo. De 0 a 15 min, BR bombea protones como resultado de la activación de la luz. De 15 a 60 min, proteoliposomas se incuban en la oscuridad, durante este tiempo, los protones se mueven pasivamente de los liposomas hasta que el pH intravesicular y pH extravesicular son iguales. De 60 a 75 min, BR sigue siendo funcional y bombas de protones sobre la iluminación. . Figura 2 Transporte de ensayo: piranina de fluorescencia, convierte a las variaciones de pH correspondientes, como una función del tiempo A) pH en el interior de los liposomas de control (círculos de color naranja); pH en el interior de proteoliposomas que contienen BR en la membrana (cuadrados de color púrpura); pH en el interior. de proteoliposomas contienen BR y MexB en la membrana sin Hoechst 33342 (d rojoiamonds); pH en el interior de proteoliposomas contienen BR y MexB en la membrana con Hoechst 33342 (triángulos grises) B) pH en el interior de los liposomas de control (círculos naranjas);. pH en el interior de proteoliposomas contienen BR en la membrana (casillas de color púrpura); pH en el interior de proteoliposomas contienen BR, MexB y MexA en la membrana sin Hoechst 33342 (diamantes azules); pH en el interior de proteoliposomas contienen BR, MexB y MexA en la membrana con Hoechst 33342 (triángulos verdes).

Discussion

Se describe un procedimiento de reconstitución diseñado para analizar el transporte de proteínas de membrana. Una vez establecido, el procedimiento de reconstitución de proteínas conduce a mediciones que son muy reproducibles. Sin embargo, las condiciones exactas para la reconstitución de la proteína variarán de una proteína a la otra. Gran parte se debe tener cuidado en la optimización de los parámetros siguientes: i) la calidad de la purificación (la pureza y la ausencia de material agregado), ii) eficacia de la etapa de solubilización de detergente (cuando sea posible, se debe preferir detergente de baja cmc porque son más fáciles de obtener deshacerse de), iii) la desorción del detergente (que es por ejemplo posible combinar el uso de perlas de poliestireno con una etapa de diálisis, pero esto puede afectar a la tasa de desorción, un parámetro crítico para la actividad subsiguiente de la proteína, ver ref [ 9]), iv) la reconstitución de lípidos (la naturaleza química de los lípidos, la relación de lípido a proteína, la presencia de amphiph adicionaliles son parámetros críticos que deben ser variadas y optimizadas). En adición la temperatura y el tiempo de incubación afecta a todas estas cuestiones.

El control de calidad es por lo tanto primordial en cada paso del procedimiento de reconstitución. Desde este punto de vista, la dispersión de luz es una técnica muy conveniente, ya que es rápida, no destructiva, y que sólo requiere de 20 l de muestra a una concentración en el rango micromolar. Una vez formados los proteoliposomas, gradiente de sacarosa es también de gran ayuda, ya que abre el camino hacia la verificación sistemática de la reconstitución: cualitativa (es la proteína de hecho incrustado en la membrana de los liposomas) y cuantitativos (cuántas proteínas en un liposoma). Este último se abordarían mediante la medición precisa de la proteína y las concentraciones de lípidos.

Nuestro ensayo no se basa en la valoración de la propia sustrato y esto evita consideraciones inquietas acerca de la posible difusión pasiva artefactual de la molécula debido a la compartimentación del hidrófobo en las membranas. El ensayo explota las propiedades de piranina como una sonda fiable y cuantitativa de los cambios de monitoreo de pH. Nuestros resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos con otro procedimiento en el que se realizó la formación de gradiente de protones utilizando valinomicina ^10, pero permite un más robusto y reproducible gradiente de ^11. Además, el gradiente de protones se puede ajustar con precisión, simplemente mediante la variación de la concentración del tampón (para más detalles ver Verchere et al. ^12).

En el procedimiento de una medición de control se lleva a cabo primero en ausencia de sustrato (esto le da acceso a la actividad pasiva de la proteína). La actividad real transportador de proteína de la membrana se mide a continuación, después de que el sustrato se ha añadido en la misma cubeta. Este es realmente un activo debido a que el experimento puede ser considerado como un resultado verdadero, no ambigua, inducido por el sustrato.

ENT "> El protocolo se podría adaptar a medio-alto rendimiento (por ejemplo 96-pozos mediciones) automatización debido a la iluminación de la muestra desencadena la reacción. Automatización y paralelización consistirían en la preparación de un gran lote de proteoliposoma, y ​​en la dispensación de alícuotas en un 96 habría entonces que añadir pozos placa. Sustratos (y también los inhibidores posibles) y después de la incubación en la oscuridad durante 45 min la placa sería sometido a ciclos de medición de fluorescencia iluminación / piranina en un lector de microplacas.

Para obtener información adicional sobre el protocolo, se invita a los lectores a leer Verchere et al ^12,13.

Materials

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatography empty column	Biorad	732-1010
Desalting columns	Bio-Rad	54805
Dynamic light scattering instrument	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometer JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A