Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo
Summary
Se describe aquí el uso de una variante de proteína fluorescente verde sensible al pH, pHluorin, para estudiar la dinámica espacio-temporal de los receptores de guía de axones que se trafficking en la superficie celular. El receptor marcado con pHluorin se expresa tanto en cultivo celular como in vivo,utilizando la electroporación del embrión de pollito.
Abstract
Durante el desarrollo, los receptores de guía de axones juegan un papel crucial en la regulación de la sensibilidad de los axones a las señales atractivas y repulsivas. De hecho, la activación de los receptores de guía es el primer paso de los mecanismos de señalización que permiten que las puntas de los axones, los conos de crecimiento, respondan a los ligandos. Como tal, la modulación de su disponibilidad en la superficie celular es uno de los mecanismos que participan en el establecimiento de la sensibilidad del cono de crecimiento. Describimos aquí un método para visualizar exacto la dinámica espacio-temporal de la superficie de la célula de un receptor de la dirección del axón in vitro e in vivo en la médula espinal del polluelo que se desarrolla. Aprovechamos la propiedad de fluorescencia dependiente del pH de una variante de proteína fluorescente verde (GFP) para detectar específicamente la fracción del receptor de guía de axones que se dirige a la membrana plasmática. Primero describimos la validación in vitro de tales construcciones dependientes del pH y detallamos aún más su uso in vivo,en la cuerda espinal del polluelo, para evaluar la dinámica espacio-temporal del receptor de guía de axones de interés.
Introduction
Durante su navegación, los axones integran múltiples señales ambientales que los guían hacia su objetivo. Estas señales activan los receptores de guía en la superficie de los terminales de los axones, los conos de crecimiento, que a su vez inician una vía de señalización adecuada. Por lo tanto, la regulación temporal y espacial de la distribución de la superficie celular de los receptores es fundamental para establecer la sensibilidad del cono de crecimiento1. En este contexto, el cruce de la línea media por axones comisurales es un excelente modelo para investigar la regulación de los niveles de superficie celular del receptor. En la médula espinal en desarrollo, los axones commissurales son inicialmente atraídos hacia la placa del piso ventral donde cruzan la línea media. Después del cruce, pierden su capacidad de respuesta a los atrayentes de la placa del piso y ganan respuesta a los repelentes de la placa del piso para que puedan salir de la placa del piso y navegar hacia su destino final en el lado contralateral del sistema nervioso2,3. La regulación de la disponibilidad del receptor en la superficie del cono de crecimiento es uno de los mecanismos subyacentes al cambio de capacidad de respuesta a las señales de la línea media4,5. Por lo tanto, la monitorización selectiva de los receptores presentes en la membrana plasmática de los conos de crecimiento es de primordial importancia. Se describe aquí un método basado en la propiedad de fluorescencia dependiente del pH de una proteína fluorescente verde (GFP) variante para visualizar específicamente los receptores de guía axón que se dirigen a la membrana plasmática in vitro e in vivo,en el desarrollo de la médula espinal polluelo.
Rothman y sus colegas diseñados por mutaciones puntuales variantes sensibles al pH de GFP, incluida la eclíptica pHluorin6. La pHluorgina eclíptica tiene la propiedad de ser no fluorescente cuando se expone al pH ácido (<6), mientras que es fluorescente a pH neutro. Esto permite distinguir los receptores no fluorescentes localizados en compartimentos ácidos intracelulares(es decir, endosomas, vesículas de tráfico) de los receptores fluorescentes incorporados a la membrana plasmática y, por lo tanto, expuestos al pH neutro extracelular7. Aprovechamos esto para monitorizar la localización de la membrana plasmática de plexinA1, un receptor de guía axón que media la respuesta del cono de crecimiento a la semaforina repelente de línea media 3B5 (Figura 1A). Se describe aquí la caracterización in vitro de una construcción de pHluorin-plexinA1, junto con en ovo electroporación8-10 de esta construcción en la médula espinal polluelo en desarrollo seguido por el análisis microscópico de criosecciones que permiten seguir la dinámica del receptor de orientación axón in vivo con resoluciones espaciales y temporales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para seguir la dinámica de un receptor de guía de axones tanto en cultivo celular como en el contexto de desarrollo de la médula espinal del embrión de polluelo.
Para diseñar una proteína etiquetada con pHluorin de novo, es necesario considerar dos puntos con respecto a la estrategia de clonación. En primer lugar, la etiqueta de pHluorin debe exponerse a la luz de los endosomas ácidos y, en consecuencia, al compartimento …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas por su ayuda. Este trabajo cuenta con el apoyo de CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B y A.J cuentan con el apoyo de las becas La Ligue contre le cancer y Labex DevWeCan, respectivamente.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
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