Этот протокол описан способ быстрого сбора изображений Arabidopsis рассаду, реагирующих на стимул тяжести с использованием коммерчески доступных-планшетные сканеры. Метод позволяет недорогой, в больших объемах захвата изображений, поддающихся для алгоритмов вниз по течению анализа с высокой разрешающей способностью.
Научно-исследовательская в биологии все чаще требуют использования методологий, которые позволяют в больших объемах сбора данных с высоким разрешением. Задача лаборатории могут столкнуться является разработка и достижение этих методов. Наблюдение фенотипов в процессе интерес является типичным цель исследовательских лабораторий, изучающих функции гена, и это может быть достигнуто путем захвата изображения. Частности процесс, который поддается наблюдению с использованием подходов визуализации является корректирующие рост корня проростков, что был смещен с соответствие с вектора силы тяжести. Визуализации платформы, используемые для измерения реакции корень гравитропической могут быть дорогими, относительно низким в пропускной способности, и / или трудоемким. Эти вопросы были решены, разработав метод захвата изображения с высокой пропускной помощью недорогих, но с высоким разрешением, планшетные сканеры. Используя этот метод, изображения могут быть захвачены каждые несколько минут на 4800 точек на дюйм. Нынешнее положение дел позволяет коллекцию 216 индивидуальных гesponses в день. Данные изображения, собранные имеет достаточно качества для приложений анализа изображений.
Коллекция фенотипической данных с высоким разрешением полезно в исследованиях, которые направлены, чтобы понять взаимодействие генетики и окружающей среды в посредничестве организменном функцию 1,2. Исследования этой природы также по существу больших масштабах, что делает его дополнительно необходимо, чтобы методы, используемые для измерения фенотипы в данном контексте быть высокой пропускной 3,4. При установлении методов phenomics-масштабного исследования, компромиссы между производительностью и разрешением вступают в игру. Методы, которые выше пропускной также имеют тенденцию быть ниже в резолюции, что делает его труднее обнаружить малые эффекты генетики и окружающей среды 5. Кроме того, методы, которые более тщательно измеряют нужный фенотип также имеют тенденцию быть ниже в пропускной способности, что затрудняет обследование генетические и экологические последствия широко. Кроме того, ручные методы количественной оценки фенотипов, в том числе визуального осмотра, могут быть подвергнуты изменению в связи с различиями в человеческом первосприятие 6.
Обработки изображений технологии могут обеспечить полезный мост между пропускной способностью и разрешением в получении фенотипических наблюдений 7-9. В общем, изображение относительно легко захватить, облегчая пропускную способность, и при приеме на достаточное разрешение, тонкие фенотипы могут быть обнаружены 1,2,7. Imaging Technologies, как правило, изменяемый, чтобы соответствовать систему или процесс интересов и, как правило, масштабируемая 10-12. Из-за этого, технологии обработки изображения идеально подходят для развития крупномасштабных исследований функции организменном.
Реакция первичного корня к гравитационной стимул сложный физиологический процесс, который происходит в пределах морфологически простым органа. Ответ включает в себя активацию путей, которые распространяются через корневую органа и ее развитие, определяется экологических и генетических факторов, в том числе генетических факторов под влиянием окружающей среды 12-14 сигнализации </suр>. Отклик первичной корня к тяжести стимул был изучен, по крайней мере со времен Дарвина, но есть много, чтобы узнать о том, как это работает, особенно на ранних сигнальных событий и в факторах, опосредующих отклика пластичности 12,14,15. Получение детального понимания динамики этой реакции важно в поиске путей улучшения способности саженцев успешно утвердиться в данной среде 16. Кроме того, форма корня делает его доступным для приложений обработки изображений 8,12,17. Взятые вместе, корень гравитропической ответ является идеальной системой для развития технологий визуализации высокой пропускной с целью проведения исследований геномика-уровня функции организменном.
В этом докладе, высокой пропускной метод высокого разрешения для захвата изображения ответа корень гравитропической используя недорогие, имеющиеся в продаже планшетные сканеры представлена. Обзорпротокол показан на рисунке 1. Рассаду высаживают на чашках были расположены на вертикально-ориентированные планшетные сканеры оснащены держателями пользовательские оргстекла пластины. Изображения были собраны каждые несколько минут на 4800 точек на дюйм и сохраняются на локальном диске или сервере данных. Метаданные, связанные с каждой серии изображение хранится в базе данных и сохраненные изображения обрабатываются. Подход использует VueScan программное обеспечение для захвата изображения. VueScan может быть использован для запуска более 2100 различных сканеров на Windows, Mac, или операционных систем Linux (см. материалы таблицу). Разрешение сканера из 4800 руб использовался в этом приложении, которое соответствует разрешению достигнутый в ходе предыдущих исследований с использованием фиксированных камер CCD 1,8,12. Гибкость VueScan программного обеспечения наряду с общим интерфейсом он использует для любого сканера он работает позволяет пользователям легко принять практически любой сканер аппаратные средства достаточным разрешением к протоколу, представленный в этой статье. Текущий пропускная позволяет для сбора216 индивидуальные ответы в день. Технология гибкой и масштабируемой для использования в учреждениях, начиная от вузов, чтобы исследовательских университетов. Кроме того, изображение, собранные имеют достаточного качества для приложений анализа изображений.
Точная фенотипическая наблюдение имеет решающее значение для понимания проявлений функции гена в организме. Один из способов приобрести фенотипическую информацию через захвата данных изображения с высоким разрешением. Платформа сканер на основе разработаны позволило коллекцию многими изображениями (200 изображений / период сканирования) в высоком разрешении (4800 точек на дюйм) в течение ряда часов. Кроме того, эта платформа легко адаптировать к различным лабораторных условиях и в классе из-за гибкости VueScan программного обеспечения для запуска тысячи различных сканеров, использующих общий интерфейс 18.
Метод, представленный здесь заполняет пустоту в высокой пропускной захвата изображения, который простирается от крупных фенотипирования объектов и автоматизированных систем реализуемых в одной лаборатории. Платформы с высокой пропускной имеющиеся в настоящее время, как правило, использовать специализированное оборудование изображений, в том числе камер, установленных на роботизированных опор, для захвата изображений с высоким разрешением рrimarily над землей растительных тканей (например, центр для растений интегративной технологии и ScanAlyzer HTS по LemnaTec) 20,21. Специализированные системы визуализации с использованием рентген и технологии МРТ были также разработаны для картинки в поле ниже наземных тканей с замечательной резолюции, как они растут в среде почвы (например, центр по завод интегративной технологии) 11,22,23. Эта разработка более специализированных технологий, как правило, за счет пропускной способности, что делает динамические фенотипические исследования более трудным. Важно отметить, что стоимость и инфраструктуры потребности в этих высокого класса платформ сделать их в основном невозможным для реализации в небольших лабораториях.
Платформы были также разработаны, которые используют более стандартной технологии захвата изображения и хорошо подходят для измерения динамических характеристик, таких как корневой ответ на тяжести стимула. Например, ПЗС-камеры были использованы для захвата индивидуальных ответов рассады к свету и гравитации при высокихпространственное и временное разрешение 1,8,12. Другие системы были разработаны позволяет измерять кончика корня ориентации кратных корней из одного изображения (например, RootTipMulti со стороны iPlant Collaborative) 17,24. В первом случае, пропускная способность относительно низким при условии, что только один саженец изображается каждой камеры одновременно, в то время как в последнем случае пропускная способность выше, но в целом за счет разрешении.
Процедура, описанная в этой статье представляет собой платформу для захвата изображений с высоким разрешением в высокой пропускной способности с оборудования и программного обеспечения, которые легко доступны и относительно доступным. Используя эту настройку, 1080 индивидуальных ответов корневые могут быть собраны в неделю в одном лаборатории, оснащенной берегу шести сканеров. В 15 месяцев сбора в среднем 864 индивидуальных ответов в неделю, в общей сложности 41 625 саженцев были отсканированы для исследования геномики. Около 15% индивидуальных коллекций не удалось из-за ошибок установки, NetwoОтказ гк или неисправность оборудования. Еще 22% ответов не удалось из-за отсутствия прорастания или недостаточного роста корней, чтобы вызвать реакцию роста. Окончательный набор данных состоит из 27475 отдельных ответов рассады до гравитационного стимула от 163 рекомбинантных инбредных линий плюс 99 вблизи изогенных линий. Данные были собраны в одной лаборатории, делая это очень высокой пропускной подход. Даже учитывая, что оборудование, используемое для приобретения является относительно недорогим, он надежно функционировала на протяжении двух лет, даже с тяжелым использования.
Хотя этот протокол был очень полезен для исследовательских целей этой группы, некоторые ограничения все еще существуют. Из-за пропускной способностью около 50 Гб данных несжатых изображений в день, было очевидно, что большое количество пространства было необходимо для размещения изображений, если не могут быть разработаны эффективные схемы сжатия. Проблема хранения временно решена путем приобретения внешних жестких дисков для каждого компьютера. Кроме того, два 1Сетевые 0 ТБ связанные устройства хранения были приобретены. Позже были разработаны алгоритмы сжатия, как описано выше, который может помочь уменьшить размер данных на 60% (рис. 8). Важно отметить, что скорость, с которой данные могут быть сохранены на сетевом устройстве хранения данных, связанного зависит от скорости сетевого соединения. Схемы сжатия также была ограничена в связи с желанием предотвратить потерю данных изображения.
Рассматриваются также и другие ограничения, характерные для системы формирования изображений на основе. Например, в подход сканера на базе саженцы подвергаются воздействию света высокой интенсивности в белых и потенциально инфракрасном диапазонах в течение каждого сканирования. Это, вероятно, влияет на рост рассады, хотя саженцы еще можно наблюдать пройти надежные ответы на тяжести стимула (рис. 7). Будущее улучшение может быть связано программирования сканеры такие, что только инфракрасные светодиоды являются активными. Площадь в активном РАЗВИТИЕт является создание алгоритмов анализа хорошо согласована с разрешения и пропускной способности этих данных изображения. Большой набор данных, полученных с помощью этого метода сканера основе была идеально подходит для разработки надежных инструментов для высокой пропускной фенотипирования изображений рассады. Алгоритм сжатия работают на этих изображениях, показанных на рисунке 7 поддерживает утверждение, что они поддаются приложений анализа изображений. Кроме того, изображения, могут быть проанализированы ранее опубликованной алгоритма, RootTrace 17,24, если они собраны в более низком разрешении (менее 1200 точек на дюйм), а отдельные саженцы сегментированы из изображения с использованием алгоритма сжатия, описанный выше перед анализом. Данные роста корней может быть извлечена из изображений уменьшенного до 1200 руб в то время как угол наконечник данные могут быть извлечены из изображений уменьшенного до 900 руб (неопубликованные наблюдения).
Процедура, описанная в этой статье вписывается в свою нишу в мире кенгурут томография в том, что высокая пропускная способность и высокое разрешение в то же время относительно доступным. Дополнительным преимуществом такого подхода является то, что она легко может быть настроена для удовлетворения потребностей визуализации конкретного исследовательской группы.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась за счет гранта от Национального научного фонда (награда числа IOS-1031416) и было проведено в сотрудничестве с Натан Миллер, Логан Джонсон и Эдгара Spalding университета Висконсина и Брайан Bockelman, Карл Лундстедт и Дэвид Свенсон из Университет Голландии ВЦ Небраски.
Epson Perfection V700 Photo Scanners | Epson | B11B178011 | – |
Plexiglas Scanner Template | – | – | Custom made. See Figure 2. |
Smart Strap Bungee Cords | SmartStraps | Wal-Mart 1079478 | |
Brinks Digital Outdoor Timers | Brinks | Wal-Mart 42-1014-2 | |
VueScan Software | Hamrick Software | http://www.hamrick.com | |
Segmentation Software | Chris Wentworth, Doane College | https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation | |
3M Micropore Tape | Fisher Scientific | 19-061-655 | – |
Holding racks | – | – | Custom made by gluing two cookie racks together. |